TNF-α诱导MLO-Y4细胞发生RIP3介导的程序性坏死

发布时间：2019-07-31 17:03

【摘要】：目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)能否诱导小鼠长骨骨样细胞株MLO-Y4发生程序性坏死及其发生机制。方法:将MLO-Y4细胞分为正常对照(control)组、TNF-α处理组、TNF-α+necrostatin-1(Nec-1)处理组、TNF-α+Z-VAD处理组和TNF-α+受体相互作用蛋白3(RIP3)-siRNA组。用流式细胞术检测各组细胞凋亡或坏死率,透射电镜鉴定细胞形态学变化,用Western blot法测定RIP1、RIP3和cleaved caspase-3的蛋白水平,应用激光共聚焦显微镜观察RIP1和RIP3蛋白的共表达,应用荧光标记法检测各组细胞活性氧(ROS)水平。结果:TNF-α诱导MLO-Y4细胞24 h,凋亡和坏死率明显高于control组(P0.01)。与TNF-α组相比,Nec-1、Z-VAD和RIP3-siRNA均能降低细胞的凋亡或坏死率(P0.01)。在TNF-α组可见大量坏死样细胞,在Z-VAD组仍可见到坏死样细胞,而在Nec-1和RIP3-siRNA组未见到坏死样细胞。Western blot实验结果显示Nec-1可有效抑制RIP1蛋白表达,而Z-VAD对RIP1和RIP3蛋白表达无影响,RIP3-siRNA可有效降低RIP3蛋白表达(P0.01)。与TNF-α组比较,Nec-1可有效降低RIP1-RIP3蛋白共表达阳性细胞百分率(P0.01),而Z-VAD对其无影响。与control组相比,TNF-α组的ROS水平明显增高(P0.01);与TNF-α组相比,Nec-1、Z-VAD及RIP3-siRNA均能有效抑制ROS水平(P0.01)。结论:TNF-α能诱导MLO-Y4细胞发生RIP3介导的程序性坏死;ROS可能是MLO-Y4细胞程序性坏死的执行者。
【图文】：

Figure2．Comparisonofapoptosis/necrosisrateineachgroup．Mean±SEM．n=3．##P＜0．01vscontrolgroup;＊＊P＜0．01vsTNF-αgroup．图2各组MLO-Y4细胞凋亡或坏死率的比较组同样可以见到坏死的细胞。而TNF-α+Nec-1和TNF-α+ＲIP3-siＲNA组未发现明显坏死的细胞，仅见少数细胞线粒体呈轻度肿胀，见图3。Figure3．ThemorphologicalchangesofMLO-Y4cellswerevisualizedbyTEM．Thescalebar=2μm．图3透射电镜观察各组MLO-Y4细胞形态学变化4TNF-α对MLO-Y4细胞程序性坏死特异性蛋白表达的影响ＲIP1和ＲIP3是程序性坏死发生过程中的关键信号分子，且二者相互作用参与形成促程序性坏死小体［11］。本实验应用激光共聚焦显微镜检测了ＲIP1和ＲIP3蛋白在MLO-Y4细胞的共表达情况。镜下可见ＲIP1和ＲIP3蛋白主要表达于细胞胞浆，ＲIP1(红色)和ＲIP3(绿色)阳性细胞表达重叠呈黄色，见图4。共表达阳性率结果显示，，与对照组相比，TNF-α组细胞ＲIP1和ＲIP3的共表达阳性率明显增高(P＜0．01)，Nec-1和ＲIP3-siＲNA能有效降低MLO-Y4细胞ＲIP1和ＲIP3共表达阳性率(P＜0.01)，见图5。应用Westernblot检测程序性坏死关键蛋白ＲIP1、ＲIP3及凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3的表达水平。与对照相比，TNF-α组的ＲIP1、ＲIP3及cleavedcaspase-3蛋白水平明显增高(P＜0.01)。Nec-1能有效抑制ＲIP1蛋白的表达(P＜0.01)，而·1502·

Figure2．Comparisonofapoptosis/necrosisrateineachgroup．Mean±SEM．n=3．##P＜0．01vscontrolgroup;＊＊P＜0．01vsTNF-αgroup．图2各组MLO-Y4细胞凋亡或坏死率的比较组同样可以见到坏死的细胞。而TNF-α+Nec-1和TNF-α+ＲIP3-siＲNA组未发现明显坏死的细胞，仅见少数细胞线粒体呈轻度肿胀，见图3。Figure3．ThemorphologicalchangesofMLO-Y4cellswerevisualizedbyTEM．Thescalebar=2μm．图3透射电镜观察各组MLO-Y4细胞形态学变化4TNF-α对MLO-Y4细胞程序性坏死特异性蛋白表达的影响ＲIP1和ＲIP3是程序性坏死发生过程中的关键信号分子，且二者相互作用参与形成促程序性坏死小体［11］。本实验应用激光共聚焦显微镜检测了ＲIP1和ＲIP3蛋白在MLO-Y4细胞的共表达情况。镜下可见ＲIP1和ＲIP3蛋白主要表达于细胞胞浆，ＲIP1(红色)和ＲIP3(绿色)阳性细胞表达重叠呈黄色，见图4。共表达阳性率结果显示，与对照组相比，TNF-α组细胞ＲIP1和ＲIP3的共表达阳性率明显增高(P＜0．01)，Nec-1和ＲIP3-siＲNA能有效降低MLO-Y4细胞ＲIP1和ＲIP3共表达阳性率(P＜0.01)，见图5。应用Westernblot检测程序性坏死关键蛋白ＲIP1、ＲIP3及凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3的表达水平。与对照相比，TNF-α组的ＲIP1、ＲIP3及cleavedcaspase-3蛋白水平明显增高(P＜0.01)。Nec-1能有效抑制ＲIP1蛋白的表达(P＜0.01)，而·1502·
【作者单位】： 海南医学院第一附属医院脊柱骨病外科;海南医学院第一附属医院肾病风湿科;
【基金】：海南省自然科学基金资助项目(No.817326)
【分类号】：R580

【参考文献】

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【共引文献】

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【二级参考文献】

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本文编号：2521463