内质网应激在高糖诱导系膜细胞表型转化中的作用研究

发布时间：2017-03-18 01:01

  本文关键词：内质网应激在高糖诱导系膜细胞表型转化中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景 目前糖尿病肾病(DN)的发病率在全世界范围内正在急剧增加，是引起终末期肾衰竭的最常见原因，其病情进展快，治疗难度大，由于其发病机理尚未完全阐明，缺乏有效防治手段，致残致死率高，已经成为肾脏医学领域最急迫需要解决的问题。糖尿病肾病的主要病理特征是HGMCs增殖和胞外基质(ECM)聚集。在此病理过程中，高血糖引起的HGMCs的表型转化是一个关键性环节，表现为HGMCs肥大、α-SMA的异常表达、ECM大量分泌等。大量研究认为，高糖刺激细胞代谢应激反应的多效性是典型的信号网络失衡，DN发病与肾小球的血流动力学改变、系膜细胞多元醇代谢途径异常、蛋白非酶糖化和大分子糖化终末产物(AGEs)的生成、细胞因子的异常表达等因素密切相关。而目前的研究表明，内质网应激(ERS)很可能就是高糖所致细胞内信号反应网络失衡的总开关。内质网作为细胞内最大的细胞器之一，具有大面积的膜结构，其内质网膜内外除合成折叠的蛋白质外，还驻留有大量的信号蛋白分子，故其发挥的功能远远不止既往认为的蛋白质糖基化以及辅助蛋白质正确折叠，事实上它在将细胞质信号与线粒体、细胞核功能偶联方面发挥了重要作用，扮演着关键角色。目前，内质网作为细胞浆信号网络调节的整合器这一功能已受到高度重视。而既往研究已证实，糖尿病引起的高糖状态可以诱导包括HGMCs在内的多种肾脏靶细胞发生ERS。由此推测，对ERS进行调控进而对DN高糖环境诱导的HGMCs发生细胞表型转化产生作用，可能影响DN肾脏损伤的进程，从而有可能为有效的治疗糖尿病肾病的找到新的思路。而已在多种动物模型中成功应用的4-苯基丁酸(4-PBA)是一类小分子伴侣，近期研究发现它可以运输突变蛋白，从而具有稳定蛋白构象，改善内质网折叠能力。因此，予以4-PBA进行干预来控制ERS的轻度，可能为DN的临床治疗提供新的途径。 目的 本研究拟用高糖刺激HGMCs，动态观察在高糖环境下，系膜细胞表型转化情况和发生内质网应激的情况，其次，通过应用分子伴侣4-PBA调控内质网应激强度观察对系膜细胞在高糖刺激下的作用，以期明确高糖诱导HGMCs发生表型转化过程中内质网应激的作用并初步阐明其机制。 方法 1.将培养的HGMCs分为NC组、高糖组(HG组)和HG+4-PBA组。 2.采用CCK-8试剂盒进行细胞增殖率测定。 3.使用流式细胞仪进行细胞周期测定。 4.免疫组化方法检测HGMCs中的α-SMA表达。 5.实时定量RT-PCR方法测定各组各时相点重要分子如Grp78、TGFβ1、FN、NOX4、NF-kB的基因表达相对量(RQ)。 6.用Western-blot方法测定各组各时相点上述重要分子的蛋白表达水平变化情况。 结果 1.高糖刺激HGMCs早期即发生内质网应激反应，而药物分子伴侣4-PBA可以抑制内质网应激反应的发生。具体而言，Grp78是重要的内质网分子伴侣，其特异性的表达标志着内质网应激反应的发生。对照组Grp78mRNA始终处于较低的表达水平；而予以高糖刺激后Grp78mRNA表达在早期(6h)即较对照组显著上调，其表达在12h达高峰，而后逐渐下降，但仍显著高于对照组；予以药物分子伴侣4-PBA可明显的抑制高糖诱导的Grp78mRNA表达上调，差异有统计学意义。同时，高糖刺激后，与对照组相比Grp78蛋白表达明显增加，而予以4-PBA干预可以明显抑制这种增高趋势。 2.高糖刺激后系膜细胞增殖明显增快，与对照组差异有统计学意义；细胞增殖指数PI值也显示明显升高；高糖刺激同时给予小分子伴侣4-PBA(5mmol/L)干预，系膜细胞增殖活性在48h受到显著抑制，而细胞增殖指数则从24h起即受到显著抑制，差异有统计学意义。 3.对照组系膜细胞存在低水平的α-SMA表达，高糖刺激可增加α-SMA表达。用5mmol/L4-PBA干预可以显著抑制高糖诱导的α-SMA表达。应用IPP软件分析荧光强度显示，HG组显著高于正常对照组，而应用4-PBA干预后使荧光强度较HG组降低，差异有统计学意义。 4.予以高糖刺激后TGFβ1mRNA的表达较正常对照组明显增加，在24h左右达高峰，显著高于对照组。而予以化学分子伴侣4-PBA可明显的抑制由高糖诱导的TGFβ1mRNA的表达上调，差异有统计学意义。同样的，高糖刺激可诱导TGFβ1蛋白的表达明显增加，而予以4-PBA干预后可以抑制增高趋势。 5.予以高糖刺激后FN mRNA的表达明显增加，在24h左右达高峰，，显著高于对照组。而予以化学分子伴侣4-PBA可明显的抑制由高糖诱导的FN mRNA的表达上调，差异有统计学意义。 6.予以高糖刺激后Nox4mRNA的表达明显增加，显著高于对照组。而予以化学分子伴侣4-PBA可明显的抑制由高糖诱导的Nox4mRNA的表达上调，差异有统计学意义。 7.予以高糖刺激后NF-kB mRNA的表达明显增加，显著高于对照组。而予以化学分子伴侣4-PBA可明显的抑制由高糖诱导的NF-kB mRNA的表达上调，差异有统计学意义。 结论 1.高糖培养条件下可诱导人肾系膜细胞发生表型转化，即由静息型向活跃型转化，表现为细胞形态学发生改变，亚细胞结构中内质网等细胞器增生活跃；同时细胞增殖速度、增殖指数等均高于对照组；免疫细胞学研究表明高糖诱导下人肾系膜细胞大量合成表达α-SMA是细胞发生表型转化的有力证据； 2.在高糖诱导人肾系膜细胞发生表型转化的过程中早期即有内质网应激反应的参与，而应用药物分子伴侣4-PBA可以抑制此过程中的内质网应激反应； 3.应用分子伴侣4-PBA早期调控内质网应激反应可以显著对抗高糖培养诱导人肾系膜细胞表型转化的作用，并抑制此过程中一些关键细胞因子如TGF-β1、FN等mRNA及其蛋白合成，提示调控内质网应激可能通过抑制上述关键分子的表达完成对细胞表型转化的抑制作用； 4.在此过程中，应用分子伴侣4-PBA早期调控内质网应激反应同样可以显著下调高糖培养诱导人肾系膜细胞表型转化过程中氧化应激通路以及炎症反应通路的关键细胞因子如Nox4、NF-kB等mRNA的表达，并同样的抑制其蛋白合成，提示高糖诱导人肾系膜细胞发生表型转化是多条信号通路、多种细胞因子参与的复杂信号网络失衡的过程，而调控内质网应激可能正是该信号网络调控的关键点。 综上所述，高糖可诱导体外培养的人肾系膜细胞发生细胞表型转化，表现为过度增殖并上调α-SMA、TGF-β1、FN等的表达，此过程中伴随有ERS的发生，且抑制ERS程度可相应的抑制细胞增殖及下调HGMCs表达α-SMA、TGF-β1、FN等重要因子。同时，此过程中还有其他信号通路的参与，如Nox4、NF-kB等也发生了类似变化，这提示了ERS在此过程中对胞内信号网络失衡的重要调节作用，ERS确实发挥了胞浆信号整合的关键作用。因此，下一步深入探讨如何通过调控ERS强度、持续时间，改变细胞生理或病理反应的走向，将对临床治疗DN提供重要的新方向。
【关键词】：糖尿病肾病 人肾脏系膜细胞 内质网应激 细胞表型转化 分子伴侣4-苯基丁酸
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R587.2;R692.5
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-9
• 中文摘要9-12
• 1. 前言12-14
• 2. 材料与方法14-25
• 3. 结果25-35
• 4. 讨论35-42
• 全文结论42-43
• 参考文献43-50
• 文献综述 内质网应激在糖尿病肾病中的研究进展50-57
• 参考文献54-57
• 在读期间发表论文57-58
• 致谢58

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