人鼠嵌合B7-2抗体对狼疮样肾病型的免疫干预效应及分子机制研究

发布时间：2020-02-13 22:51

【摘要】：系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是以产生多种自身抗体,全身多系统、多器官受累为特征的自身免疫性疾病,狼疮样肾病(lupus nephritis,LN)是该疾病最严重的并发症。目前,该疾病的发病机制尚无明确定论,可能与环境、遗传等多种因素有关。B7-2分子是表达于抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC)表面重要的共刺激分子,B7-2分子通过与T细胞表面的CD28分子结合,可产生促进T细胞活化、增殖、分化以及发挥免疫效应所必需的共刺激信号。此信号的缺乏可导致T细胞进入无反应状态(Anergy)或者免疫耐受(Tolerance),甚至引起细胞程序性死亡(Apoptosis)。研究表明,B7-CD28共刺激信号通路在SLE的发生、发展中起重要作用。因此,应用特异性B7抗体阻断或削弱该信号通路,可抑制自身免疫应答,减轻SLE的病理损伤,为治疗此类疾病提供了高效、特异的生物治疗方法。传统鼠源性抗体因其免疫原性,应用于人体易产生人鼠抗体反应(Human anti-mouse antibody,HAMA),影响治疗效果。采用基因工程技术设计出的人鼠嵌合抗体,保留了鼠源抗体特异性和亲和力,大大降低抗体免疫原性,避免HAMA反应,同时具有介导ADCC效应、CDC效应及免疫调理作用。本课题通过建立与人类SLE疾病类似的慢性移植物抗宿主病(c GVHD)小鼠狼疮样肾病模型,应用自行研制的人鼠嵌合B7-2抗体对该疾病模型进行干预,进而从免疫学、血清学及肾脏组织形态学等方面观察抗体对疾病模型病理损伤的逆转效应及其分子机制。一、人鼠嵌合B7-2抗体制备及鉴定目的:制备人鼠嵌合B7-2抗体并鉴定其生物学活性。方法:复苏本科室保存的稳定分泌人鼠嵌合B7-2抗体的细胞株4F4,采用细胞大规模培养、超滤浓缩及免疫亲和层析等技术制备人鼠嵌合B7-2抗体;流式细胞术分析人鼠嵌合B7-2抗体对不同细胞膜型B7-2分子的识别。结果:4F4细胞培养上清中的抗体得率约为4mg/L,人鼠嵌合B7-2抗体与L929-B7-2、Daudi以及小鼠脾脏细胞的阳性结合率分别为99.0%,93.7%和63.0%。结论:人鼠嵌合B7-2抗体能够特异性识别不同细胞膜型B7-2分子。二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼疮样肾病模型的建立及生物学鉴定目的:构建慢性移植物抗宿主病(c GVHD)小鼠狼疮样肾病模型并对其进行生物学鉴定。方法:将20只6~8周龄雌性(C57BL/J6×BALB/c)F1雌鼠随机分成两组,造模组小鼠于0、3、7和11d经尾静脉注射亲代雌性BALB/c小鼠脾脏细胞,107/100μL/只。对照组应用同体积生理盐水处理。末次注射后第七天,流式细胞术分析小鼠脾脏中抗原递呈细胞(MHC-II+)与抗体产生相关细胞(B220+)的活化程度;每2周定期检测血清中抗双链ds DNA抗体、ANA的含量;每月定期采集晨尿检测尿蛋白含量。3个月后处死小鼠,经HE染色观察肾脏病理变化,直接免疫荧光法分析免疫复合物(IC)的沉积,透射电镜观察肾小球超微结构的改变。结果:造模组小鼠脾脏中抗原递呈细胞(MHC-II+)与抗体产生相关细胞(B220+)的活化程度明显增强(p0.05);建模第2周,造模组80%的小鼠血清中可检测到抗ds DNA抗体和ANA,第4周时达到90%;建模3个月,造模组80%的小鼠可检测出蛋白尿,蛋白含量为++~++++;HE染色观察显示,造模组小鼠出现肾小球肿胀及炎性细胞浸润;直接免疫荧光法显示,造模组小鼠肾小球部位有大量IC沉积;造模组小鼠透射电镜下可见肾小球致密物沉积、基底膜节段性增厚等病理改变。结论:慢性移植物抗宿主病小鼠狼疮样肾病模型构建成功。三、人鼠嵌合B7-2抗体对小鼠狼疮样肾病模型的免疫干预效应及分子机制的研究目的:探讨人鼠嵌合B7-2抗体通过阻断B7/CD28信号通路对小鼠狼疮样肾病模型的免疫干预效应及其分子机制。方法:按上述建模方法,将40只F1代雌鼠随机分为4组,即造模组、抗体干预组、CTX组及对照组。末次淋巴细胞注射后,干预组小鼠于第1、3、5、8及15天经尾静脉注射人鼠嵌合B7-2抗体,200μg/只,之后每隔1个月注射一次,连续注射3个月;CTX组于第1、2天腹腔注射CTX2.5mg/只。流式细胞术分析小鼠脾脏中抗原递呈细胞(MHC-II+)与抗体产生相关细胞(B220+)的活化程度;每2周定期检测血清中抗双链ds DNA抗体、ANA的含量;每月定期采集晨尿检测尿蛋白含量。3个月后处死小鼠,经HE染色观察肾脏病理变化,直接免疫荧光法分析免疫复合物(IC)的沉积,透射电镜观察肾小球超微结构的改变。结果:免疫荧光及流式细胞术分析结果显示,抗体干预组小鼠脾脏中抗原递呈细胞(MHC-II+)与抗体产生相关细胞(B220+)的活化程度明显低于造模组(p0.05);造模第4周时,造模组90%的小鼠血清能检测到抗ds DNA抗体和ANA的表达,而抗体干预组的检出率仅为30%,且抗体滴度明显低于造模组;造模第3个月时70%的造模组小鼠出现蛋白尿,蛋白含量为++~++++,抗体干预组仅有20%,且蛋白含量为+~++;HE染色观察显示,造模组肾脏组织出现肾小球肿胀,炎性细胞浸润等症状,抗体干预组小鼠肾小球体积轻微增大,周围少许炎性细胞浸润,小鼠肾脏病理学改变明显轻于造模组;直接免疫荧光法发现造模组小鼠肾小球部位有大量IC沉积,抗体干预组的肾小球轮廓较清晰,IC的沉积明显少于造模组;通过透射电镜对超微结构的观察,发现造模组出现致密物沉积、基底膜节段性增厚等病理改变,抗体干预组未出现明显病理改变。CTX组小鼠上述指标与抗体干预组均无明显差别。结论:人鼠嵌合B7-2抗体通过削弱或者封闭B7-CD28信号通路,可抑制机体免疫细胞异常活化,逆转狼疮样肾病病理损伤,提示该类特异性抗体对防治SLE或c GVHD等疾病具有潜在的应用价值。
【图文】：

L929-mock L929-B7-2Daudi Spleen cells图1 人鼠嵌合B7-2抗体对不同细胞膜型B7-2分子的识别讨 论目的蛋白的产量一直是嵌合抗体制备过程中的难点。已有研究表明，在一定的杂交瘤细胞密度下，目的蛋白的产量与细胞生长的速率呈正相关，当杂交瘤细胞密度过大时，目的蛋白的产量反而降低。因此，当细胞增殖到高密度时，采用一定手段抑制细胞的进一步增殖，，细胞的代谢却并未停止，仍在持续分泌表达目的蛋白。鉴于此，本研究在 4F4 细胞株生长到合适密度时（即细胞铺满细胞瓶底80%~90%），将培养基更换为无血清的基础培养基，使得细胞的增殖速度减慢，但是抗体仍在持续分泌。这样不仅避免了完全培养基影响抗体的纯度，也大大减少了抗体纯化时杂蛋白的量。随后采用 Protein G 亲和层析柱对嵌合抗体进行纯化

实验4周时血清中抗dsDNA抗体表达(X400
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.241

【参考文献】

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本文编号：2579277