Dicer对小鼠白色脂肪组织棕色化的影响及其机制研究

发布时间：2020-03-01 16:07

【摘要】：目的观察Dicer基因脂肪组织特异性敲除后小鼠内脏脂肪占体重的比例变化及内脏脂肪棕色化程度,再诱导Dicer基因敲除的内脏脂肪前体细胞向棕色脂肪细胞分化,探索其可能的分子调控机制,从而阐述Dicer基因与小鼠内脏白色脂肪棕色化的关系。方法1.转基因小鼠的构建:实验中,我们将Dicerflox/flox小鼠与Adiponectin-Cre小鼠杂交,从而得到了Adiponectin-Cre;Dicerflox/flox脂肪组织特异性Dicer基因敲除小鼠。记录小鼠每周体重增长及食物摄入重量。2.转基因小鼠体内试验:测定6周成年小鼠的体重,对实验组和对照小鼠进行糖耐量试验。提取小鼠内脏脂肪组织称重,然后4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片后HE染色,比较实验组和对照组脂肪细胞的大小。抽提内脏白色脂肪RNA,检测组织中UCP1(解耦联蛋白-1)基因的表达量。3.Dicer对内脏脂肪前体细胞诱导分化成棕色脂肪细胞的调控作用:从Dicerflox/flox小鼠内脏脂肪组织内提取前体细胞,通过感染 LV-Cre-GFP病毒和LV-GFP病毒,模拟基因敲除后向棕色脂肪细胞分化的过程。通过油红染色鉴定脂肪细胞的形成和观察脂肪细胞的形态;3.应用实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)技术检测棕色脂肪细胞形成相关基因、线粒体标志基因及产热基因表达的变化;应用Western Blot技术检测细胞解偶联蛋白UCP1的表达差异。以此来探索Dicer基因对小鼠白色脂肪棕色化影响的机制。结果1.与对照组小鼠相比,Dicer基因脂肪组织特异性敲除小鼠内脏脂肪含量减少(p0.005),小鼠糖代谢的能力也增强,两组结果具有统计学意义(p0.05)。2.实验组小鼠内脏脂肪组织中脂肪细胞体积比对照组小鼠中的体积减小(p0.01),其UCP1基因表达增加,两组结果具有统计学差异(p0.005)。3.Lentivirus-Cre-GFP病毒感染组细胞经棕色脂肪诱导液诱导成成熟的脂肪细胞后在形态上与对照组(Lentivirus-GFP感染组)无明显差异,油红染色均显示有多房脂滴。进一步研究发现实验组细胞与棕色脂肪分化相关的转录因子Prdm16、PGC-1α表达量明显增高,产热基因UCP-1和线粒体标记基因COX8b、COX4也明显升高,且实验组细胞 UCP-1蛋白水平表达量高于对照组,两组数据有统计学差异(p0.005)。结论Dicer基因脂肪特异性敲除可减少小鼠内脏脂肪含量,提高小鼠糖代谢水平。其作用机制可能是与Dicer基因调控白色脂肪前体细胞向棕色脂肪细胞分化有关。Dicer基因敲除促进内脏白色脂肪前体细胞棕色化,增加能量消耗,从而减轻内脏脂肪蓄积。
【图文】：

搅拌，加热，再加 57.1ml 醋酸，充分搅拌，，再加双蒸水定容至 室温保存。5.封闭液：1g 的 BSA+3ml 10% Triton+97ml PBS6.75%乙醇的配置：无水乙醇与双蒸水 3 比 1 比例混合即可。7.2mg/ml I 型胶原酶的配置：100mg 胶原酶溶解于 50ml PBS 中，0.22um滤过，-20 度储存备用。．实验方法（一）转基因小鼠的构建(1).为研究Dicer基因对脂肪组织的影响，我们构建了脂肪组织Dicer基特异敲除小鼠Adiponectin-Cre；Dicerflox/flox和对照Dicerflox/flox小鼠，前者是脂组织中Dicer被敲除的实验组小鼠，后者是没有基因敲除的对照组小鼠。

结 果1．基因型鉴定结果如图1所示，Adiponectin-Cre；Dicerflox/flox小鼠(KO) 和Dicerflox/flox小鼠(WT), DNA电泳条带显示如下,Cre条带大约500bp左右,Dicer约400bp左右。图1 实验小鼠模型基因鉴定
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R589.2

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