【摘要】：目的 摸索ERK-MAPK通路抑制剂PD98059最佳浓度和作用时间,探讨ERKMAPK信号通路在氟致原代培养海马神经元突触可塑性损伤中的调控作用,探讨氟暴露损伤海马神经元突触可塑性的分子机制,为揭示氟暴露损害学习记忆的分子机制提供理论依据。方法 抑制剂PD98059最佳浓度和作用时间的摸索:取新生24h内的SPF级SD大鼠仔鼠海马组织进行体外培养海马神经元,培养成熟的海马神经元分别暴露于抑制剂终浓度为0.0(空白对照)、5、10、25、50、100μmol/L的培养基中24h;抑制剂最佳浓度的培养基中0、3、6、12、24、48h。CCK-8法检测海马神经元存活率;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定海马神经元培养上清液中LDH活力;RTqPCR法检测细胞中ERK、CREB mRNA的表达水平;Western-blot法检测细胞中ERK、p-ERK1/2、CREB、p-CREB蛋白表达水平。经统计分析,得出最佳抑制剂浓度和作用时间。ERK-MAPK通路的调控作用:课题组前期实验得出最佳氟处理浓度和作用时间分别为0.8μg/ml、24h。细胞分四组:空白对照组、0.8μg/ml氟处理组,25μmol/L抑制剂组、25μmol/L抑制剂+0.8μg/ml氟处理组,分别处理24h。光学倒置显微镜观察海马神经元突起数量;CCK-8法检测海马神经元细胞存活率;激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子水平;RT-qPCR法测定细胞中ERK1/2、CREB、BDNF、突触相关蛋白突触素(SYN)、生长相关蛋白43(GAP-43)、突触后致密蛋白95(PSD-95)的mRNA表达水平;Western-blot法测定细胞中ERK、p-ERK1/2、CREB、p-CREB、磷酸化钙调激酶Ⅱ(pCaMKⅡ)、BDNF、SYN、GAP-43蛋白表达水平。结果 1细胞存活率在不同抑制剂处理组间差异有统计学意义(P0.05),50、100μmol/L组细胞存活率低于空白对照、5、10、25μmol/L组(P0.05),24h、48h组细胞存活率低于0h、3h、6h、12h组(P0.05)。2海马神经元培养上清液LDH活力在不同抑制剂组差异有统计学意义(P0.05),25、50、100μmol/L组海马神经元LDH活力高于空白对照、5、10μmol/L组(P0.05),12h、24h、48h组海马神经元LDH活力高于0h、3h、6h组(P0.05)。3 ERK1/2、CREB mRNA表达水平在不同抑制剂组差异有统计学意义(P0.05),25、50、100μmol/L组ERK1/2、CREB mRNA表达水平低于空白对照、5、10μmol/L组(P0.05),12h、24h、48h组ERK1/2、CREB mRNA表达水平低于0h、3h、6h组(P0.05)。4 p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达水平在不同抑制剂组差异有统计学意义(P0.05),25、50、100μmol/L组p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达水平低于空白对照、5、10μmol/L组(P0.05),12h、24h、48h组p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达水平低于0h、3h、6h组(P0.05)。综上得出:抑制剂最佳浓度和作用时间分别为25μmol/L、24h。5细胞存活率在不同处理方法组间差异有统计学意义(P0.05),0.8mg/L氟处理组、抑制剂+氟处理组细胞存活率低于对照组(P0.05),抑制剂+氟处理组细胞存活率高于0.8mg/L氟处理组(P0.05)。6与对照组比较,0.8mg/L氟处理组、抑制剂+氟处理组海马神经元钙离子荧光强度和pCaMKⅡ蛋白表达水平均升高(P0.05);与0.8mg/L氟处理组比较,抑制剂+氟处理组钙离子荧光强度和pCaMKⅡ蛋白表达水平降低(P0.05)。7与对照组比较,0.8mg/L氟处理组、25μmol/L抑制剂处理组、抑制剂+氟处理组ERK1/2、CREB mRNA表达水平降低(P0.05);与氟处理组比较,抑制剂+氟处理组ERK1/2、CREB mRNA表达水平降低(P0.05);0.8mg/L氟处理组、抑制剂+氟处理组SYN、GAP-43、PSD-95、BDNF mRNA表达水平低于对照组(P0.05),抑制剂+氟处理组SYN、GAP-43、PSD-95、BDNF mRNA表达水平高于0.8mg/L氟处理组(P0.05)。8 p-ERK1/2、p-CREB、BDNF、SYN、GAP-43蛋白表达水平在不同处理方法组间差异有统计学意义(P0.05)。0.8mg/L氟处理组、25μmol/L抑制剂处理组、抑制剂+氟处理组p-ERK1/2、p-CREB蛋白表达水平低于对照组(P0.05),抑制剂+氟处理组pERK1/2、p-CREB蛋白表达水平低于0.8mg/L氟处理组(P0.05);0.8mg/L氟处理组、抑制剂+氟处理组SYN、GAP-43、BDNF蛋白表达水平低于对照组(P0.05),25μmol/L抑制剂处理组、抑制剂+氟处理组SYN、GAP-43、BDNF蛋白表达水平高于氟处理组(P0.05)。结论 1 MEK抑制剂PD98059能减缓氟对体外培养海马神经元突触可塑性损伤作用。2 ERK-MAPK通路能正向调控氟对体外培养海马神经元突触可塑性损伤作用。
【图文】：
用（ x± s）表示，采用 SPSS17.0 软件进行统计学因素方差分析，多组间比较采用方差齐性检验，组用 SNK 检验（Student-Newman-Keuls）；若方差不验；检验水准 α=0.05。代海马神经元的纯度鉴定光法做纯度鉴定，海马神经元的树突在 MAP2 作用胞核在 Hoechst33258 的作用下染成蓝色荧光，最后占 Hoechst33258 所染总细胞数的比例，即为海马神下进行观察，从中随机选取 20 个视野，分别对每进行计数，得出阳性细胞占比 94.3%，，能达到实验
a：体外培养第一天；b：体外培养第二天；c:体外培养第三天；d：体外培养第四天；e：体外培养第五天；体外培养第六天；g：体外培养第七天。图 2 体外培养原代海马神经元形态学观察（×100）Fig. 2 Morphology observation of primary hippocampal neurons cultured in vitro（×100）
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R595
【参考文献】
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