建立梯度脱钙松质骨系统并研究对间充质干细胞分化及骨再生影响

发布时间：2020-03-28 05:43

【摘要】：目的:通过构建梯度脱矿的松质骨体系来研究不同矿化程度的松质骨(CBM)对骨髓来源的间充质干细胞增殖及成骨分化的影响及对骨缺损修复过程的作用。方法:利用打孔器从猪肩胛骨中获取圆柱状松质骨,利用1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)及1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液对松质骨进行脱细胞处理后,使用乙二胺四乙酸铁钠(EDTA-2Na)溶液配合超声,对松质骨分别进行0,4,8,12小时脱钙处理。对松质骨钙磷含量分布、力学性质、细胞毒性等进行分析后,将鼠骨髓来源的间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)种植于不同矿化程度松质骨中,观察细胞在松质骨材料上的黏附、伸展、增殖情况,且在细胞种植后1,2,4周,利用定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)及免疫荧光染色对细胞内成骨相关基因表达含量进行分析,包括Ⅰ型胶原蛋白(Col-1α),碱性磷酸酶(ALP),骨形成蛋白(BMP-2)等。将20只新西兰兔备皮暴露两侧股骨下端,于内外髁分别制造直径约4毫米的骨缺损,填充入脱矿0,4,8,12小时的松质骨材料,术后定期评估实验兔术区恢复情况及后肢运动能力。材料植入6,8周后,将实验兔安乐死并获取股骨下段,运用MicroCT扫描、组织学染色等手段进行标本分析,了解各组别中骨缺损修复程度、血管生成情况等,综合评估不同矿化程度松质骨材料对骨修复影响。结果:1.松质骨在超声结合EDTA-2Na溶液条件下可获得较稳定且有效的脱矿效果,钙离子浓度随脱矿时间延长而逐渐降低,在12小时后松质骨可实现完全脱矿(p0.01)。2.松质骨矿化程度下降会造成钙磷含量下降(p0.05)及分布松散,原子力显微镜分析提示材料弹性模量、黏附力下降,而材料孔隙率相应升高(p0.01),且BMP-2蛋白暴露增多。3.部分脱矿化松质骨(脱矿4,8小时)的细胞黏附和伸展能力较未脱矿骨无显著性下降,而完全脱矿骨内细胞黏附能力降低。4.间充质干细胞在部分脱矿化松质骨中表达成骨相关蛋白能力(包括Col-1α,ALP,BMP-2等蛋白)高于未脱矿及完全脱矿松质骨材料(p0.05)。5.部分脱矿松质骨在促进新生骨小梁及新生血管形成及生长的促进作用优于未脱矿及完全脱矿松质骨材料。结论:利用EDTA-2Na溶液及超声联合脱矿方法可以获得稳定的梯度脱矿松质骨体系,且部分脱矿骨在促细胞黏附、增殖、分化及骨缺损修复过程中表现优于未脱矿骨及完全脱矿骨,其机制可能与钙离子浓度调节BMP-2蛋白表达相关。
【图文】：

变化图,脱矿,成分变化,材料

图４．１邋ＣＢＭ材料经脱细胞脱矿处理后成分变化。Ａ：脱细胞前后大体图；Ｂ：逡逑脱细胞前后ＤＮＡ含量变化；Ｃ：脱矿前后大体图；Ｄ：脱矿前后钙浓度变化；Ｅ：逡逑ＥＤＳ图显示梯度脱矿后ＤＣＢＭ材料中碳、钙、磷元素分布变化图。逡逑注：图Ａ比例尺为３ｍｍ。图Ｃ比例尺为３ｍｍ。检测结果以平均值士方差呈现，逡逑

扫描图,孔隙,材料,脱矿

正文结果逡逑利用邋ｍｉｃｒｏ－ＣＴ邋扫描测量孔隙大小分别为邋２２７．２士４６．９，邋３８５．６±３０．４，邋４０２．６±７２．４，逡逑６１９±８１．３ｐｍ邋（图２Ａ－Ｂ），这提示ＤＣＢＭ的孔隙大小随着脱矿时间延长逐渐增大。逡逑Ｍａｓｓｏｎ三色染色用于观察ＤＣＢＭ材料表面的胶原纤维排布。在骨组织中，大部分逡逑胶原纤维为一型。如补充图２Ｃ所示，，Ｍａｓｓｏｎ三色染色中成熟的矿化组织被染成逡逑红色而不成熟的矿化组织及胶原纤维被染成蓝色。未脱矿的ＤＣＢＭ中胶原纤维被逡逑矿化组织覆盖。然而，当脱矿时间增加后，骨组织内可以观察到更多蓝染的区域，逡逑提示不成熟矿化组织及胶原纤维暴露增加。逡逑ｐｍ逦逦逦逡逑Ａ邋0Ｈ逦４Ｈ逦８Ｈ逦１２Ｈ邋Ｂ邋８00——－＿ｉｉｉ邋邋—逡逑．５逦－１逡逑ｑ逦ＯＨ邋４Ｈ邋８Ｈ邋１２Ｈ逡逑丫邋：逡逑图２邋ＤＣＢＭ材料ｍｉｃｒｏ－ＣＴ孔隙分析及Ｍａｓｓｏｎ染色。Ａ：不同矿化水平逡逑ＤＣＢＭ的Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ扫描图；Ｂ：根据Ｍｉｃｒｏ－ＣＴ扫描结果测得各组ＤＣＢＭ孔隙大逡逑小；Ｃ：不同矿化水平ＤＣＢＭ的Ｍａｓｓｏｎ染色。逡逑注：图Ａ比例尺为２ｍｍ。图Ｃ比例尺为５０ｐｍ。检测结果以平均值±方差呈逡逑现，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１。逡逑４．１．２原子力纤维镜下材料的超微结构分析逡逑为了更加了解脱矿后ＤＣＢＭ材料的变化，我们利用原子力纤维镜来评估不同逡逑矿化程度的ＤＣＢＭ的超微力学性质。在锋利差扫描图（图３Ａ），胶原纤维被覆盖逡逑在无机组织下，在脱矿过程中，胶原纤维更多暴露于材料表面，因此提供更多精逡逑氨酸－甘氨酸－天冬氨酸配体供细胞结合黏附。在完全脱矿的ＤＣＢＭ中
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R580

【参考文献】