单体C反应蛋白调节破骨细胞分化的机制研究

发布时间：2020-04-08 13:51

【摘要】：类风湿性关节炎(RA)是一种以慢性关节炎症和骨侵蚀为主要特征的自身免疫性疾病。RA中的自身免疫可能首先在粘膜部位响应环境损伤而触发,但是需要特异性靶向关节以引发疾病。而破骨细胞在引发关节自身免疫中具有重要作用。破骨细胞主要由NF-κB配体受体激活剂(RANKL)驱动骨髓前体细胞分化而来,可直接介导骨吸收导致关节损伤。因此,调节破骨细胞的分化和作用是治疗RA的有效策略。C反应蛋白(CRP)是RA的确定性标志物,其血液表达水平与疾病严重程度和进展密切相关。但由于CRP如何在RA潜在的病理过程中发挥作用仍未完全揭示,因此,我们通过解释CRP的构象和RANKL依赖性行为来解决这个问题。CRP由五个相同的亚基组成,但在进入局部病变时解离成单体构象,即mCRP。事实上,已确定mCRP是RA患者滑膜组织中存在的主要构象。我们通过检测不同构像CRP在破骨细胞分化中的作用,确定CRP在病理过程中发挥作用的方式和途径。我们首先使用Raw 264.7巨噬细胞系和小鼠骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)验证了CRP的构象依赖性作用。天然CRP(nCRP)与巨噬细胞仅具有较弱结合并且不能驱动破骨细胞分化;而mCRP与巨噬细胞具有强烈结合并诱导破骨细胞生成基因TRAP的高表达,导致形成具有骨吸收活性的多核破骨细胞。由于实验体系中加入多粘菌素B,因此mCRP的破骨分化作用不是由于残留内毒素的污染引起的。此外,煮沸蛋白或删除关键识别基序,即与脂筏相互作用的胆固醇结合序列(CBS;aa 35-47),均可以降低并减弱mCRP的作用。另外,与体外结果一致,在健康小鼠的颅盖上皮下注射mCRP可以导致破骨细胞数目增加和明显的骨小梁损伤。因此,我们得出结论CRP诱导破骨细胞分化取决于单体构象。我们通过利用基因表达谱分析,在mCRP处理BMDM巨噬细胞后破骨细胞分化相关基因响应于mCRP而差异表达,但经典RNAKL通路几乎不参与介导mCRP的下游效应。另外分析了由mCRP和RANKL诱导的基因表达谱之间的差异,并且通过信号转导抑制剂筛选证明它们激活不同的途径。mCRP主要通过NF-κB和磷脂酶C起作用,而RANKL信号传导涉及更广泛的网络。结果表明通过mCRP诱导破骨细胞分化不依赖于RANKL。由于mCRP似乎与RANKL的作用不同,我们探究这两种诱导剂是否在破骨细胞分化中具有协同作用。当单独应用时,RANKL比mCRP在单独诱导BMDMs中破骨细胞生成基因表达时的效力高3至10倍。然而,当与mCRP一起使用时,RANKL的作用完全消失,其净反应与单独作用的mCRP相当。在TRAP染色和骨吸收测定中也获得了类似的发现。这些结果表明,mCRP可能抑制RANKL对破骨细胞分化的活性。mCRP在发炎组织中特异性转换,因此,mCRP的作用仅限于病理性破骨细胞分化,其中过度表达的RANKL也起到主要作用。在这种情况下mCRP的总体效应可能由于RANKL而受抑制。与此推测一致,CRP敲除小鼠(CRP KO)的骨吸收表型与正常颅盖中的野生型小鼠的骨吸收表型是相同的,但在皮下注射LPS后表现出破骨细胞数量增加以及骨小梁损伤的增强。mCRP对RANKL的抑制可能是由于它们引起的信号通路之间的干扰。然而,在小鼠BMDM和外周血单核细胞(PBMC)中观察到mCRP完全和持续抑制RANKL,使得这种可能性不大可能。相反,由于它们直接的物理相互作用而产生的抑制似乎更具有可能性。通过ELISA检测发现mCRP以高亲和力结合RANKL,同时删除mCRP的主要识别基序CBS或者合成CBS肽段进行结合竞争,均可有效抑制mCRP与RANKL的结合。此外,CBS肽段在破骨细胞数目和破骨损伤面积水平上,可有效抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。因此,mCRP和RANKL之间的物理相互作用由CBS介导。
【图文】：

破骨细胞,调控基因

兰州大学博士研究生学位论文单体 C 反应蛋白调节破骨细胞分化的机制研究能单独作用诱导巨噬细胞系分化为破骨细胞的前体细胞。而 RANKL 是唯一能够直接作用并诱导巨噬细胞分化为破骨细胞前体及成熟破骨细胞的细胞因子[12]。骨保护素（Osteoprotegerin，OPG）作为 RANK 受体可以与 RANKL 因子进行竞争性结合，所以 OPG 也能够有效调节破骨细胞的分化和功能，在维持骨代谢平衡过程中发挥着重要作用[13-15]。

骨吸收

成熟的多核破骨细胞被多种信号通路激活，从而导致骨重建的开始（细胞的细胞体是极化的，并且通过 RANKL[33]响应于 RANK 的激活细胞激活后会经历细胞内部结构变化，使其准备好吸收骨基质。首先具有可改变的细骨架系统在骨表面移动，比如肌动蛋白的重排和骨表间通过紧密连接以形成密封隔室，，然后破骨细胞细胞膜褶皱可通过物产生氢离子向外输出[34]，酸化外部的密封隔室，使其 pH 降低到 4基质中的无机质溶解[35,36]。此外，破骨细胞中丰富的粗面内质网与高通过持续分泌溶解酶 TRAP 和前体-CATK 进入吸收坑（Howship's la细胞得以侵蚀下面的骨骼。同时在酸性条件下，CTSK 与 MMP-9 也有机基质胶原的降解[38-40]。所有降解产物（胶原片段与溶解的钙和磷骨细胞内被处理并通过胞吞作用转运[41]释放到循环中。体外实验中以剂量依赖性方式激活成熟的破骨细胞，并且在体内可以通过激活破导致骨吸收[42]。成熟破骨细胞的存活及其参与连续几轮骨吸收，部分胞因子调节[43]。RANKL 和白细胞介素（IL）-1 在体外和体内可有效骨细胞的存活时间，这可能是由于这些因子可诱导提升 NF-κB 的活
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.22

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