磷脂酶C非依赖的蛋白激酶C信号通路在甲状旁腺素调节骨与肌肉代谢中的作用初探

发布时间：2020-04-20 22:52

【摘要】：背景:甲状旁腺素(Parathyoid Hormone,PTH)是一种临床上常用的抗骨质疏松药物,有关其信号转导特征与其生物学作用的关系目前仍有待明了。我们的前期研究显示,PTH激活甲状旁腺素Ⅰ型受体通过nonPLC/PKC信号途径提升松质骨骨量,改善骨小梁微结构。我们已经合成了特异性激活nonPLC/PKC信号途径的PTH模拟肽(MY-1),发现MY-1肽具有成骨细胞分化的作用,但不具有激活破骨细胞的作用,体内应用发现在胫骨,具有与PTH(1-34)等效的防切卵巢后骨丢失作用。我们在同样的动物模型中发现,小鼠椎旁肌肉出现改变。骨骼肌与骨统属于运动系统,在维持机体的稳定及运动功能发挥重要作用,二者均来源于中胚层,且表达甲状旁腺素受体。人类老化的过程中,肌肉较少往往伴随骨质疏松,而肌少症引发的跌倒风险是骨质疏松骨折发生的主要原因之一。因此研究PTH对骨与肌肉代谢作用及信号分子和途径,不仅有利于骨质疏松的研究,更有利于肌少症的预防和治疗。目的:利用我们前期研究获得的PTH模拟肽,以探究各信号通路在PTH调节骨骼和骨骼肌代谢中的作用,在综合的基础上,探讨PTH对肌肉骨骼系统的影响。方法:取32只7周龄C57BL/6J雌鼠,构建去势骨质疏松模型,皮下注射PTH模拟肽。在第4周末活体检测后肢腓肠肌肌力,取胫骨行显微CT松质骨定量分析,取胫骨做硬组织切片行骨形态计量学分析。取第4腰椎椎旁肌肉做病理切片切片,HE染色观测肌纤维面积和肌纤维细胞核数量,ATP酶染色观测肌纤维类型及数量。另取5只8周龄C57BL/6J小鼠体外提取BMSC、BMMs;诱导BMSC成骨分化行茜素红染色及钙定量,碱性磷酸酶染色及酶活性测定,诱导BMMs破骨分化行TRAP染色及酶活性测定;提取3日龄C57BL/6乳鼠颅骨原代成骨细胞,Real-time PCR检测骨代谢相关基因的表达;另取5只4周龄C57BL/6J小鼠提取腓肠肌肌卫星细胞,体外诱导Real-time PCR检测成肌代谢相关基因表达。结果:(1)胫骨松质骨定量:骨小梁体积分数PTH(1-34)组、MY-1组显著高于OVX组(P0.05)与SHAM组无统计学差异;(2)胫骨上段病理切片显示:骨小梁面积百分数PTH(1-34)组、MY-1组显著高于OVX组(P0.05)与SHAM组无统计学差异,骨小梁矿化沉积率PTH(1-34)组、MY-1组显著高于OVX组(P0.05),且PTH(1-34)高于SHAM组。骨小梁单位周长破骨细胞数目PTH(1-34)组显著高于OVX组(P0.05),MY-1组与OVX组无统计学差异。(3)BMSC成骨分化:茜素红染色可见PTH(1-34)组、MY-1组较对照组钙结节明显增加,碱性磷酸酶染色可见PTH(1-34)组、MY-1组较对照组出现深蓝染色,ALP定量显示PTH(1-34)组、MY-1组酶活性显著高于对照组(P0.05),而PTH(1-34)组、MY-1组无统计学差异;(4)BMMs破骨分化:抗酒石酸酸性磷酸酶染色TRAP染色显示PTH(1-34)组TRAP阳性细胞数明显多于对照组(P0.05),酶定量测定显示PTH(1-34)组显著高于较对照组(P0.05),而MY-1组与对照组无统计学差异。(5)Real-time PCR检测颅骨原代成骨细胞及BMSC基因表达:PTH(1-34)组、MY-1组成骨特异基因(ALP,BSP OC、OPG)表达显著高于对照组(P0.05)。而PTH(1-34)组Rankl基因表达显著高于对照组(P0.05),MY-1组与对照组无显著差异。(6)腓肠肌肌力检测:OVX组最大收缩力较SHAM组显著降低(P0.05),OVX组收缩至肌颤的有效收缩次数较SHAM组显著降低(P0.05),PTH组显著高于OVX组(P0.05),而MY-1组与OVX组无统计学差异。(7)椎旁肌病理切片:HE染色观察OVX组肌纤维平均横截面积较SHAM大,单根肌纤维平均细胞核数减少(P0.05),PTH(1-34)组与SHAM组无统计学差异,MY-1组与OVX组无统计学差异;ATPase染色观察OVX组I型及II a型肌纤维数量较SHAM组低,II b型肌纤维较SHAM组高(P0.05),而PTH组I型及II a型肌纤维数量较OVX高,II b型肌纤维数量低于OVX(P0.05)。(8)成肌相关基因表达:成肌分化基因(Myf5、Myf6)PTH(1-34)组和MY-1组显著高于con组,(MyHc I、MyoG)基因MY-1组显著高于 con 组(P0.05),MyoD 基因 PTH(1-34)显著低于 con 组(P0.05)。结论:没有证据表明nonPLC/PKC通路PTH模拟肽MY-1促进破骨细胞的形成和分化,但能减轻由雌激素减退所致的骨质疏松,与PTH(1-34)接近。PTH(1-34)可以逆转卵巢切除导致的肌纤维结构的改变和收缩力的降低,nonPLC/PKC信号通路模拟肽MY-1具有与PTH(1-34)不同的作用。
【图文】：

ｒｓ逦ＳＨＡＭ逦ＯＶＸ逦ＯＶＸ＋Ｐ邋０．１２７邋土０．００６＊逦０．０９５±０．００６逦０．１１８士邋０４．１２８邋土０．１９０逦４．０８０±０．３４４逦３．８５５士００．０５６士０．００４逦０．０５２±０．００５逦０．０７１邋±００．２４９士０．０１８逦０．２４８士０．０２０逦０．２７４土０９３．３８７±２５．３９２逦６６．５０７±３２．０１７逦１０７．７８０１．２６４土０．１３２逦１．２８０±０．７５４逦１．２７１邋±０ｏＣＴ扫描应用ＰＴＨ模拟肽４周的骨小梁参数结果，＊Ｐ＜０．０５ｖｓＯＶＸ。（数据引ｏ邋ＣＴ邋ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｓｈａｗｅｄ邋ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ邋ｂｏｎｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｌｏｇｕｅ邋ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋４邋ｗｅｅｋｓ．邋＊Ｐ＜０．邋０５ｖｓＯＶＸ（Ｄａｔａ邋ｃｉｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｔｏｎｇｓ）逡逑

图１－２邋４周末小鼠胫骨上段骨组织病理切片Ａ：各组胫骨上段硬组织切片Ｍａｓｓｏｎ－Ｇｏｌｄｎｅｒ逡逑ＴＨｃｈｒｏｍｅ染色（２0ｘ）、胫骨上段硬组织切片黄绿色双荧光标记（２０0ｘ）、胫骨上段石蜡逡逑切片ＴＲＡＰ染色（２０0ｘ）邋Ｂ：胫骨上段硬组织切片骨小梁面积百分数、胫骨上段硬组刀片逡逑＊
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R580

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本文编号：2635054