【摘要】：目的:氟是一种人体所必需微量多的氟时会引起以氟骨症、氟斑牙为主要病理表现的慢性氟中毒。流行病学调查元素之一,当机体摄入过结果显示,高氟地区儿童青少年出现骨骼发育延缓,骨龄延迟现象;动物实验、器官培养研究结果表明氟可通过抑制软骨内成骨过程,进而抑制长骨纵向生长。软骨内成骨是骨形成最主要途径之一,位于初级、次级骨化中心之间的生长板软骨不断进行软骨内成骨过程,形成驱动骨纵向生长的重要力量。软骨内成骨受生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ)等多种全身激素、Ihh/PTHrP、FGFs等信号通路及Sox9、Runx2等相关转录因子共同作用。表皮生长因子受体(EGFR)是软骨代谢的重要调控因子,对软骨细胞的增殖、分化以及破骨细胞的生成过程起到调控作用。氟是否通过EGFR信号通路抑制软骨内成骨过程尚未见报道。为此,我们通过构建氟中毒大鼠模型观察不同浓度的氟对生长板软骨细胞的增殖、分化、肥大、基质矿化、血管侵入、破骨细胞生成等软骨内成骨各过程的影响,并初步探讨氟是否通过影响EGFR信号通路调控软骨内成骨过程,为阐明氟抑制长骨生长的机制研究提供线索,为氟骨症的防治提供依据。实验方法:本研究选取SD初断乳(60±10g)雄性大鼠,按体重随机分成四组,对照组大鼠给予蒸馏水,染氟组大鼠分别饮用含50 ppm F~-、100 ppm F~-、150 ppm F~-的NaF水溶液,染毒周期为12周。染毒周期结束后,测量大鼠体长、股骨、胫骨长度,取左侧胫骨固定包埋制备石蜡切片;右侧胫骨取生长板软骨,制备电镜标本观察氟对软骨细胞超微结构的影响。大鼠血清通过ELISA方法检测IGF-Ⅰ含量;胫骨石蜡切片行HE染色、阿利新蓝/VG双染观察大鼠生长板形态结构;BrdU染色法检测软骨细胞增殖;TRAP染色试剂盒检测破骨细胞生成;以及通过免疫组织化学染色检测各组大鼠生长板软骨软骨内成骨各过程相关蛋白表达(COL II、COL X、Sox9、Runx2、Mig6、p-EGFR、MMP-13、VEGF、RANKL、OPG)。结果:1、氟对大鼠体重、体长以及食物利用率的影响:实验周期内,各染氟组大鼠平均体重均低于对照组;自第6周开始,150 ppm F~-组大鼠体重开始明显低于对照组,差异具有统计学意义(P0.05);染氟周期结束后,与对照组相比,150 ppm F~-组大鼠体尾长度明显变短,差异具有统计学意义(P0.05);150ppm F~-组大鼠胫骨长度明显低于对照组、50 ppm F~-、100 ppm F~-组,差异具有统计学意义(P0.05);100 ppm F~-组大鼠股骨长度较对照组相比明显降低,差异具有统计学意义(P0.05);150 ppm F~-组大鼠股骨长度较对照组、50 ppm F~-组相比明显下降,差异具有统计学意义(P0.05);经统计分析,各组大鼠食物利用率均无明显变化。2、氟对大鼠血清IGF-Ⅰ含量的影响:各染氟组大鼠血清IGF-Ⅰ含量低于对照组,随染氟浓度的增加呈下降趋势,150 ppm F~-组显著低于对照组,差异具有统计学意义(P0.01)。3、氟对大鼠生长板软骨形态结构的影响:对照组生长板软骨边界清晰,软骨细胞呈柱状排列,骨小梁平行排列于软骨细胞柱;染氟组大鼠骨骺端生长板边界紊乱,骨小梁变短、变薄、排列稀疏,出现骨小梁断裂现象。较对照组相比,各染氟组生长板总高度、增殖区高度增高,差异都具有统计学意义(P0.05);150 ppm F~-组大鼠生长板肥大区高度增加最为明显,差异具有统计学意义(P0.05);各组大鼠生长板软骨增殖区与肥大区高度比值均无明显差异;染氟组大鼠生长板肥大区软骨细胞数略有增加;染氟组大鼠生长板肥大区软骨细胞纵向直径与染氟浓度呈正比,150 ppm F~-组软骨细胞纵向直径增加最为显著,差异具有统计学意义(P0.05)。4、氟对大鼠生长板软骨细胞超微结构的影响:对照组软骨细胞核形态规则、染色质分布均匀,内质网清晰、排列整齐;染氟组软骨细胞核形态出现不规则样改变、染色质聚集于核周,线粒体肿胀、溶酶体增多以及内质网扩张,150 ppm F~-组大鼠软骨细胞出现凋亡前现象,内质网扩张成池,溶酶体增多。5、氟对大鼠生长板软骨细胞增殖的影响:较对照组相比,各染氟组大鼠生长板软骨细胞增殖减少,BrdU阳性细胞率随染氟浓度增加呈下降趋势,150 ppm F~-组差异有统计学意义(P0.05)。6、氟对大鼠生长板软骨细胞相关蛋白表达的影响:染氟组大鼠生长板软骨细胞COLⅡ、p-EGFR、MMP-13、Runx2、VEGF蛋白的表达含量下降,COLⅩ、Sox9、Mig-6、OPG蛋白表达增加。7、氟对大鼠生长板破骨细胞生成的影响:较对照组相比,各染氟组破骨细胞数随染氟浓度的增加呈下降趋势,150 ppm F~-组明显减少(P0.05)。结论:1、氟可能通过降低全身激素IGF-Ⅰ表达水平抑制骨生长。2、氟可抑制软骨细胞增殖、引起软骨细胞分化障碍,并通过抑制EGFR信号通路引起破骨细胞生成障碍,进而影响软骨内成骨过程。3、氟可能通过上调Sox9、下调Runx2等转录因子的表达阻碍软骨基质降解矿化及血管侵入过程,进而抑制软骨内成骨。
【图文】：
中国医科大学硕士学位论文3 结果3.1 氟对大鼠体重、体长、食物利用率的影响.1.1 氟对大鼠体重的影响结果染氟 12 周内，各组大鼠体重均随着周龄的增加而增加，，各染氟组大鼠平重均低于对照组（见图 1）。自第 6 周开始，150 ppm F-组大鼠体重开始明于对照组大鼠，差异具有统计学意义（P<0.05）。
-组大鼠食物利用率均无明显变化（见图2）。图 2 各组大鼠体重食物利用率3.2 氟对大鼠血清 IGF-Ⅰ含量的影响各组大鼠血清IGF-Ⅰ含量检测结果如图3所示，对照组大鼠血清IGF-Ⅰ含量为1084.1±195.27 ng/ml；50 ppm F-组大鼠血清IGF-Ⅰ含量为1066.37±238.59 ng/m；100 ppm F-组大鼠血清IGF-Ⅰ含量为848.8±414.7 ng/ml；150 ppm F-组大鼠血清
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R599.1
【参考文献】
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