TNF-α抑制剂调节强直性脊柱炎小鼠肠道菌群及其作用机制的研究

发布时间：2020-05-12 05:00

【摘要】：研究背景强直性脊柱炎(AS)是一种主要侵犯患者脊柱和骶髂关节的慢性自身免疫性炎症疾病。AS的病因尚未明确,至今尚无有效的根治办法。有研究表明AS的发病是遗传和环境因素相互作用的结果,其中肠道菌群失调在该疾病的发生发展中起着重要的作用。近年来研究发现抗TNF-α类生物制剂对AS具有较好的疗效,但仍有部分患者应用TNF-α抑制剂治疗后效果不佳或无效。关于TNF-α抑制剂治疗AS的确切机制目前仍不甚明确。有研究表明TNF-α抑制剂的治疗可以改变炎症性肠病宿主的肠道菌群,同时沉默TNF可以延缓因年龄增长而改变的小鼠肠道菌群改变。那么,TNF-α抑制剂对AS的治疗效果是否与改变宿主肠道菌群和肠道通透性有关?目前仍不清楚。研究目的建立蛋白聚糖诱导的AS模型小鼠明确TNF-α抑制剂的治疗作用;分析抗TNF-α治疗后AS小鼠肠道菌群变化;阐明TNF-α抑制剂的作用机制与肠道菌群的关系,为临床合理选择和应用TNF-α抑制剂治疗AS提供理论依据。研究方法30只雌性BALB/c小鼠随机分为对照组,模型组,治疗组。牛源软骨蛋白聚糖和佐剂制成混悬液腹腔注射构建AS模型小鼠。治疗组于诱导后的第10周开始给予益赛普(rhTNFR:Fc)连续腹腔注射4周,对照组与模型组给予等体积的生理盐水注射。FITC-葡聚糖法检测各组小鼠肠道通透性;小鼠踝关节进行苏木精伊红(HE)染色;ELISA检测小鼠血液中IL-17A和TNF-a的浓度;对小鼠的回肠组织进行HE染色;同时运用免疫组化、Western blot分析小鼠肠道上皮紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达情况;16S rDNA高通量测序分析各组小鼠肠道菌群构成。研究结果1.TNF-α抑制剂有效降低模型组小鼠关节发病率和关节评分及体重丢失,踝关节HE结果显示模型组小鼠出现大量炎症细胞浸润,滑膜增生。但在治疗组中仅出现少量的细胞浸润。ELISA结果提示治疗后模型小鼠血清的IL-17A和TNF-α水平显著下降。2.模型组小鼠的肠道绒毛紊乱,结构破坏,甚至从基底部分离。治疗组小鼠仅表现出轻微的肠道粘膜损伤。血清FITC-葡聚糖发现TNF-α抑制剂可以降低模型小鼠的肠道通透性,同时提高肠道上皮紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达。3.AS模型小鼠的肠道菌群与对照组比较存在明显的差异,提示模型小鼠存在肠道菌群紊乱的现象。与对照组相比,模型组AS小鼠肠道菌群在门水平上拟杆菌门显著降低,厚壁菌门显著升高。经TNF-α抑制剂治疗后治疗组小鼠的肠道菌群中拟杆菌门升高,厚壁菌门降低,与对照组相似。KEGG功能预测分析显示模型组小鼠以细胞迁移,膜转运和信号转导的基因为特征,而治疗组小鼠以核苷酸代谢,信号分子交互的基因为特征。研究结论TNF-α抑制剂对AS小鼠的治疗作用与改善AS肠道菌群紊乱及促进宿主肠道屏障功能的恢复有关。
【图文】：

逦ｗｅｅｋｓ逡逑图２－１：邋ＴＮＦ－ａ抑制剂治疗延缓强直性脊柱炎发病。逡逑图２－１Ａ：治疗方案；图２－１Ｂ：关节炎发病率；图２－１Ｃ：关节炎评分（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）；逡逑图２－１Ｄ：体重变化。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ２－１邋：ＲｈＴＮＦＲ：邋Ｆｃ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｇｒｅｓｓ邋ａｎｄ邋ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｌｏｓｓ邋ｏｆ邋ＰＧ－ｉｎｄｕｃｅｄ逡逑ｍｉｃｅ．邋（Ａ）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｓｃｈｅｄｕｌｅ．邋（Ｂ）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ邋ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ．邋（Ｃ）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ邋ｓｃｏｒｅ邋（ＰＧ邋ｇｒｏｕｐ邋ｖｓ逡逑ｒｈＴＮＦＲ：Ｆｃ邋ｇｒｏｕｐ邋＊邋ｐ＜０．０５，邋＊＊邋ｐ＜０．０１）．邋（Ｄ）Ｂｏｄｙ邋ｗｅｉｇｈｔ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｈｒｅｅ邋ｇｒｏｕｐｓ逡逑（ｎ＝１０／ｇｒｏｕｐ）邋ｗｅｒｅ邋ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ邋ａｆｔｅｒ邋ｔｈｅ邋ｔｈｉｒｄ邋ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．逡逑２．３．２踝关节ＨＥ染色结果逡逑ＨＥ染色结果显示相对健康对照组小鼠，模型组小鼠的踝关节染色有较多逡逑炎症细胞浸润，滑膜多量增生，关节软骨破坏以及出现了骨侵蚀（图２－２Ｂ）。ＴＮＦ－ａ逡逑抑制剂治疗后，小鼠的踝关节炎性细胞浸润程度明显降低，出现了轻微的关节逡逑间隙变窄

逦模型组（Ｂ）逦治疗组（Ｃ）逡逑图３－２：回肠ＨＥ染色（４００Ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｍｉｃｅ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｓｍｏｏｔｈ邋ｖｉｌｌｉ邋ａｎｄ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｇｌａｎｄｓ，邋ＰＧ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｍｉｃｅ邋ｓｈｏｗｉｎｇ逡逑ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄ邋ｖｉｌｌｕｓ邋ａｎｄ邋ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ邋ｖｉｌｌｏｕｓ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ａｎｄ邋ｒｈＴＮＦＲ：Ｆｃ邋ｍｉｃｅ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ｍｉｌｄ邋ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ逡逑ｏｆｖｉｌｌｉ逡逑３．３．３回肠免疫组化逡逑三组小鼠回肠组织的ＺＯ－１和Ｏｃｃｌｕｄｉｎ的免疫组化结果如图３－３，绒毛上皮逡逑细胞之间的目标蛋白为棕黄色。从结果来看，ＺＯ－１和Ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白在对照组小逡逑鼠的肠道绒毛上皮之间棕黄色颜色较深，，在模型组小鼠中颜色比较浅，而经过逡逑ＴＮＦ－ａ抑制剂治疗的治疗组小鼠的颜色得到一定程度的恢复，说明治疗后回肠逡逑的紧密连接蛋白表达量得到恢复，对Ｚ０－１和Ｏｃｃｌｕｄｉｎ蛋白的定量研究见下。逡逑－｜｜幽＿逡逑。－W灥＿逡逑对照组（Ａ）逦模型组（Ｂ）逦治疗组（Ｃ）逡逑图３－３：回肠组织的Ｚ０－１和Ｏｃｃｌｕｄｉｎ免疫组化。Ｚ０－１和ｏｃｃｌｕｄｉｎ阳性蛋白呈棕色，颜色的逡逑３０逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.23

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本文编号：2659700