高脂饮食通过激活睾丸间质细胞亲环素D抑制类固醇激素合成急性调节蛋白表达

发布时间：2020-05-16 04:52

【摘要】：研究背景:长期大量的高脂饮食(HFD)诱导的肥胖已经成为了男性睾酮缺乏(TD)的主要原因之一,然而具体机制尚不明确。睾酮生物合成是一个复杂的多步骤过程,涉及多种中间物质的转化,发挥调控转化作用的关键分子包括类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)及3β-羟化类固醇脱氢酶(3β-HSD)等。作为睾酮生物合成过程中第一个且起限速作用的关键分子,StAR协助胆固醇跨过线粒体双层膜至线粒体基质内膜侧。对于StAR功能的维持,线粒体功能的稳态具有不可或缺的重要意义。而在维持线粒体功能稳态的过程中,亲环素D(CypD)起到了重要的调节作用。研究目的:本实验首先建立高脂饲料喂养小鼠模型,探索其对血清及睾丸内睾酮水平、StAR和CypD表达水平以及线粒体的影响。然后结合CypD过表达及CypD基因全敲两种小鼠模型,进一步阐明CypD在高脂饮食诱导的StAR表达下调中的作用。研究方法:1.构建高脂饲料(HFD)喂养的小鼠模型:随机将普通饲料(ND)喂养至8周龄的C57BL/6小鼠分成两组,一组继续ND喂养,另一组给予高脂饲料(HFD)喂养,换成HFD后再喂养16周,期间每两周记录一次体重;于第16周结束时,采用X射线检测小鼠全身各部体脂分布,观察小鼠体型、睾丸大小及附睾周围脂肪量,使用生化仪检测血脂谱水平,分别使用总睾酮(TT)及黄体生成素(LH)相对应的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测小鼠血清及睾丸组织内相应的性激素水平,采用油红染色观察睾丸组织脂质沉积分布。2.在高脂喂养16周时,采用了 RT-PCR技术检测睾丸组织中StAR、P450scc及3β-HSD在HFD组和ND组之间mRNA表达水平的差异。3.应用了 Western Blot技术及免疫荧光染色法(immunofluorescence,IF)进一步检测了 HFD对StAR蛋白表达水平的影响。4.应用透射电子显微镜检测了 HFD对睾丸间质(Leydig)细胞线粒体产生的影响。5.高脂饲料喂养小鼠模型中,采用RT-PCR和Western Blot技术探究HFD对睾丸组织CypD mRNA和蛋白表达水平的影响。6.构建CypD过表达小鼠模型:选取8周龄C57BL/6小鼠,每周通过尾静脉注射1次含CypD DNA(ppif)的腺病毒(Ad-PPIF)或空载对照腺病毒(Ad-EGFP),共注射了 2周,分别使用了RT-PCR和Western Blot技术检测小鼠睾丸内CypD和StAR在mRNA和蛋白表达水平的变化。7.CypD基因全敲(Ppif-/-)小鼠模型的构建:由Ppif-/-小鼠与C57BL/6野生型(Ppif+/+)小鼠杂交10代,产生杂合型(Ppif+/-)雌、雄小鼠,作为父、母本,然后通过雌雄小鼠(Ppif+/-)杂交,产生同窝对照的敲除型(Ppif-/-)和野生型(Ppif+/+)两组小鼠。在小鼠8周龄时,换用HFD喂养16周。采用Western Blot技术检测小鼠睾丸内CypD和StAR蛋白表达水平的变化。结果:1.构建HFD喂养的小鼠模型成功:HFD组小鼠体重上升趋势较ND组更加明显;从高脂喂养第4周起,两组体重差异具有显著的统计学意义(p0.05)。HFD组小鼠无论是整体还是会阴部体脂分布率均显著高于ND组(p0.05)。HFD组小鼠较ND组小鼠体型明显肥胖;HFD组小鼠睾丸体积稍小于ND组,而其附睾周围脂肪含量明显多于ND组。生化仪分析显示,血脂谱中仅有甘油三酯(TG)浓度在两组间无统计学差异;HFD组血清中的总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)以及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度均显著高于ND组(p0.05)。ELISA结果显示,虽然与ND组相比,HFD组的T和LH浓度均在数值上减小,但是两种性激素在两组间的差异均无统计学意义;HFD组睾丸组织内的睾酮浓度低于ND组,差异有统计学意义(p0.05)。油红染色结果显示,与ND组相比,HFD组睾丸间质组织中脂质沉积明显增多。2.在高脂喂养16周时,RT-PCR检测显示,与ND组相比,HFD组StAR mRNA表达水平显著下调(p0.05);P450sccmRNA水平在数值上表现为升高,但无统计学差异;3β-HSDmRNA水平表达量呈显著增加(p0.05)。3.Western Blot及灰度分析结果表明,HFD组StAR相对于内参蛋白actin的表达量比ND组明显下调(p0.05)。免疫荧光染色结果显示,HFD组代表StAR蛋白的绿色荧光比ND组少。4.透射电镜结果显示,与ND组相比,HFD组睾丸间质Leydig细胞线粒体内外膜间隙增大。5.HFD组中CypDmRNA和蛋白表达水平均显著高于ND组(p0.05)。6.构建CypD过表达小鼠模型:Ad-PPIF组小鼠CypD在mRNA和蛋白水平均显著高于Ad-EGFP组(p0.05);而Ad-PPIF组StAR在mRNA和蛋白水平较Ad-EGFP组表达下调,均有显著的统计学差异(p0.05)。7.Ppif-/-小鼠模型的构建:Western Blot及灰度分析结果表明,与Ppif+/+ HFD组相比,Ppif-/-HFD组小鼠睾丸组织的CypD蛋白表达完全被抑制;StAR蛋白表达虽略有增加,但无明显的统计学差异(p0.05)。结论及意义:高脂饮食可以通过激活CypD过表达引起线粒体功能紊乱,进而参与了高脂饮食诱导的StAR表达下调,该研究为治疗高脂饮食诱导的睾酮缺乏提供了可能的新思路。此外,该研究阐述了长期大量高脂饮食与睾酮缺乏的联系,引起人们对不健康饮食习惯的重视,提醒人们保持适度饮食。
【图文】：

２．邋ＮＤ与ＨＦＤ组Ｃ５７ＢＬ／６小鼠体脂分布情况。Ａ．小鼠体脂分布率。ｎ＝４。数值由均数士标准差来表示。＊ｐ＜０．０５由Ｓｔｕｄｅｎｔ＇ｓｔ检验得出。Ｂ．小鼠体睾丸及附睾周围脂肪的照片。逡逑．高脂饲料喂养导致小鼠高脂血症逡逑高脂饲料喂养小鼠至１６周时，眼球取血，生化仪分析血脂水平。结果显组小鼠血清中ＴＧ的浓度为（０．６２±０．２０）ｍｍｏｌ／Ｌ，ＴＣ的浓度为（２．０丨±０．丨ｏｌ／Ｌ，邋ＬＤＬ邋的浓度为（０．２１±０．０６）邋ｍｍｏｌ／Ｌ，邋ＨＤＬ－Ｃ邋的浓度为（１．９３±０．２１ｏｌ／Ｌ；邋ＨＦＤ邋组邋ＴＧ邋的浓度为（０．６８±０．丨２）邋ｍｍｏｌ／Ｌ，邋ＴＣ邋的浓度为（３．９３±１．０５ｏｌ／Ｌ，ＬＤＬ－Ｃ邋的浓度为（０．４４±０．１１）邋ｍｍｏｌ／Ｌ，邋ＨＤＬ－Ｃ邋的浓度为（２．９０±１．０２ｏｌ／Ｌ。ＨＦＤ组血清ＴＣ、ＬＤＬ－Ｃ以及ＨＤＬ－Ｃ浓度均高于ＮＤ组，且差异均显著的统计学意义（；７＜邋０．０５）；仅有ＴＧ浓度在两组间无统计学差异。逡逑６逦ｍ邋ＮＤ逦口邋ＨＦＤ逡逑

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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R589.2

【参考文献】

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本文编号：2666206