褪黑素通过调控胞内活性氧抑制单核细胞向破骨细胞分化

发布时间：2020-05-16 09:42

【摘要】：目的:骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种多原因导致骨形成受损和(或)骨吸收过度有关的骨骼相关的疾病。褪黑素(Melatonin,MT)因为其具有促进成骨细胞分化的作用,临床上已建议使用一定剂量的MT来治疗OP。但是,关于MT对骨髓单核细胞(Bone marrow monocytes,BMMs)向破骨细胞(Osteoclast,OC)分化的直接作用仍然是未知的。我们这项研究的目的就是为了观察生理或药理学浓度的MT是否会对OC分化产生影响,及其分子机制。方法:从C57BL/6小鼠的胫骨和股骨上提取并分离出BMMs,并诱导BMMs向OC分化。然后在诱导分化过程中加入生理学浓度(0.01至10nM)或药理学浓度(1至100μM)的MT,培养一定时间后,使用抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色来标记TRAP阳性的OC数量,然后检测OC特异性基因的表达水平,观察不同浓度梯度的MT对OC分化的影响。从而进一步探究其潜在的机制,以及研究沉默信息调节因子1(Silent information regulator type 1,SIRT1)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在OC分化的作用。结果:我们的研究发现药理学浓度的MT能够显著抑制BMMs向OC分化,而且随着MT浓度的增加,MT抑制破骨细胞分化的作用逐渐增强,同时发现生理学浓度的MT不能影响OC的分化。我们发现在药理浓度的MT能够显著降低BMMs分化成TRAP阳性OC的数量和OC相关的特异性基因表达的标志物数量。同时发现MT是通过阻断活化B细胞核因子κ-轻链增强子(Nuclear factorκ-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)信号通路来抑制OC的分化。同时,我们发现MT抑制OC分化与SIRT1信号通路无关联,以及使用SIRT1抑制剂不能影响MT抑制OC分化的作用。但是,我们发现当补充外源性过氧化氢(Hydrogen peroxide,H_2O_2)时,能够部分的恢复MT抑制OC分化的作用。结论:药理浓度的MT通过降低细胞内的ROS显著的抑制BMMs向OC分化。MT抑制破骨细胞分化的作用与SIRT1相关的信号通路无关联。
【图文】：

情况,处理组,细胞培养,试剂盒

图 1:（A）M-CSF 对 BMMs 增值情况的影响。细胞在加入 20ng/ml 的 M-CSF 和缺乏 M-CSF 的情况下进行细胞培养。在培养至 0 时、48 时和 96 时，我们观察到对照组和 M-CSF 处理组均出现类似圆形的细胞形态。（B）通过 CCK-8 试剂盒测量后，我们发现在培养至 24 时、48 时、72 时和 96 时，空白对照组和 M-CSF 处理组中 BMMs

处理组,肌动蛋白,表达水平,独立实验

在 RANKL 处理组中破骨相关基因 TRAP（图 2D）、CSTK（图 2E）和 OSCAR（图2F）的 mRNA 表达水平明显升高。然而，在仅有 M-CSF 的处理组未见到破骨相关基因升高（图 2E）。图2：RANKL诱导 BMMs 向OC 分化的作用。（A）免疫荧光结果观察到与 M-CSF处理组相比 RANKL 处理组形成一个完整的肌动蛋白环。（B）定量结果显示 RANKL处理组中肌动蛋白大小（图 2B）。（C）OC 中总核的百分比。然后，使用实时 RT-PCR测量 TRAP（D）、CTSK（E）和 OSCAR（F）mRNA 的表达水平。四个独立实验数
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R580

【参考文献】