雷帕霉素对高脂环境下不同细胞炎症信号通路的影响

发布时间：2020-05-17 10:56

【摘要】：研究背景和目的:近二十几年来肥胖发病率在全球迅猛增长,肥胖引发的众多疾病如2型糖尿病的发病率也在不断攀升,这给个人、家庭和社会带来了沉重的医疗负担。营养过剩和缺乏运动是肥胖及其相关疾病的两个重要诱因。高脂膳食不仅可导致肥胖而且可引发胰岛素抵抗等;运动则改善高脂膳食诱导的胰岛素抵抗。了解骨骼肌胰岛素抵抗机制及运动干预的生理基础,对寻找肥胖或肥胖相关疾病防治的药理靶位点具有重要意义。研究表明m TORC1持续激活及慢性低度炎症在肥胖诱导的胰岛素抵抗中起了重要作用,但m TORC1与炎症相互关系并不清楚。运动改善高脂膳食诱导的骨骼肌胰岛素抵抗,机制也不清楚。本研究拟利用不同细胞进行相关细胞学实验,观察不同细胞NF-κB活性及其相关信号,从细胞层面阐明高脂膳食对NF-κB信号通路调节以及炎症信号的影响,雷帕霉素对高脂诱导的炎症因子的影响。本研究有助于揭示胰岛素抵抗新机制及运动干预的生理基础,为肥胖诱导的胰岛素抵抗防治提供新思路。研究对象与方法:首先体外培养大鼠骨骼肌L6细胞、大鼠原代脂肪细胞、肝脏BRL-3A细胞,分别分化为成熟的细胞后,(1)然后将分化的骨骼肌细胞、脂肪细胞、肝脏细胞置于浓度为0.5m M和0.2m M的软脂酸孵育液中孵育,孵育在0.2m M软脂酸中的细胞分别在0h,1h,3h,6h,12h,24h进行收样,用于蛋白定量和荧光PCR定量。(2)选取0.5m M浓度软脂酸孵育液中孵育的骨骼肌细胞、脂肪细胞、肝细胞再分别分为两组:高脂组、高脂+雷帕霉素组、并在0h,1h,3h,6h,12h进行收样,分别用于蛋白定量和荧光PCR定量等。研究结果:(1)在孵育不同浓度软脂酸后,骨骼肌细胞中P65m RNA、IL6m RNA、TNF-αm RNA均上调,其中Rel Bm RNA仅在0.5m M浓度软脂酸孵育后有上调,蛋白P65、P-P65、Rel B、P-Rel B、IL-6、TNF-α均上调;脂肪细胞中,P65m RNA、Rel Bm RNA、IL6m RNA、TNF-αm RNA均上调,蛋白P-P65、P-Rel B、IL6、TNF-α均上调;肝细胞中P65m RNA、Rel Bm RNA、IL6m RNA、TNF-αm RNA均上调,蛋白P-P65、IL6、TNF-α均上调;且上调时我们能观察到0.5m M浓度软脂酸孵育后比在0.2m M浓度软脂酸孵育后各指标能更早地达到峰值水平。(P0.05)(2)用雷帕霉素干预0.5m M软脂酸孵育的细胞后,骨骼肌细胞中P65m RNA、Rel Bm RNA、IL6m RNA、TNF-αm RNA均上调,蛋白S6、P-S6表达降低,P65、P-P65、Rel B、P-Rel B、IL-6、TNF-α均增加(P0.05);脂肪细胞中中P65m RNA、Rel Bm RNA、IL6m RNA、TNF-αm RNA均降低,蛋白S6、P-S6表达降低,P-P65、Rel B、P-Rel B、IL-6、TNF-α均降低(P0.05);肝细胞中基因指标没有显著性变化(P0.05),蛋白S6、P-S6表达降低,P-P65、IL-6、TNF-α表达增加(P0.05)。结论:1.软脂酸可促进骨骼肌细胞,脂肪细胞,肝细胞中NF-κB通路的激活,引起炎症反应,同时NF-κB信号通路的激活和炎症因子IL6、TNF-α的上调与软脂酸有着相关的时间和剂量依赖性关系。2.雷帕霉素在不同组织细胞中的作用机制不同,在骨骼肌中进一步恶化了高脂引起的炎症反应,在脂肪细胞中却能抑制高脂引起的炎症因子的分泌,在肝脏中一定程度上恶化了炎症反应,并可能引发胰岛素抵抗。
【图文】：

图 1 分化的 L6 细胞在分别给予 0.2mM 和 0.5mM Palmitate acid 后，P65、RelB、IL6、TNF-α的 PCR 结果Western blotting 结果见图 6 和图 2，在骨骼肌细胞中，孵育在 0.5mM PA 中，P65、P-P65、RelB、IL6 蛋白表达水平 6h 与 0h 相比增加显著（p＜0.05），P-RelB、TNF-α蛋白表达水平 12h 与 0h 相比增加显著（p＜0.05）。而孵育在 0.2mM PA中，P65、P-P65、RelB、IL6 蛋白表达水平 12h 与 0h 相比增加显著（p＜0.05），P-RelB、TNF-α蛋白表达水平 24h 与 0h 相比增加显著（p＜0.05）。孵育在 0.5mM软脂酸中与在 0.2mM 软脂酸中相比，P65 蛋白表达水平在 3h、6h 有显著性差异，RelB 蛋白在 1h，6h 有显著性差异，P-P65、IL6 蛋白表达水平在 6h 有显著性差异，，P-RelB、TNF-α蛋白表达水平在 12h 有显著性差异（p＜0.05）。

图 2 分化的 L6 细胞在分别给予 0.2mM 和 0.5mM Palmitate acid 后，P65、RelB、IL6、TNF-α的 Western Blotting 结果4.1.2 Rapamycin 对不同时间的软脂酸孵育 L6 细胞时 NF-κB 轴相关信号影响荧光定量 PCR 结果见表 7 和图 3，在骨骼肌细胞中，0.5mM 软脂酸（PA）和雷帕霉素(rapamycin)共同处理过的细胞与仅仅用 0.5mM PA 处理过的细胞相比，p65、RelB mRNA 水平在 6h 显著增加（p＜0.05），IL6、TNF-αmRNA 水平在 3h，6h 时增加显著（p＜0.05）。
【学位授予单位】：广州体育学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R589.2

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