p16基因甲基化在氟所致成骨细胞异常增殖中的作用研究

发布时间：2020-05-23 20:56

【摘要】：目的:本研究充分利用贵州省燃煤污染型氟中毒病区资源,以细胞周期调控中关键分子p16基因为切入点,检测氟中毒人群p16基因转录表达及甲基化水平的改变;同时构建人成骨细胞氟中毒模型,检测氟化钠对人成骨细胞活力和细胞周期分布的影响,观察p16基因转录表达及甲基化水平改变,并进一步使用DNA甲基转移酶抑制剂5-AZA-dC进行干预,探讨p16基因甲基化水平的改变在氟骨症发生发展中的作用,为氟中毒防治提供新的思路与方向。方法:1燃煤污染型氟暴露人群研究1.1调查对象的选择本研究依据地方性氟中毒病区划分标准GB 17018-2011,选择燃煤污染型氟中毒病区织金县荷花村为调查点,非氟中毒地区的安顺市张官村作为对照点;共筛选出调查对象380例(其中病例组295例,对照组85例)。1.2问卷调查及生物样本采集在知情同意原则下,进行问卷调查,并收集调查对象的生物样本(血样、尿样)。1.3尿氟(Urinary fluorine,UF)检测及分组采用氟离子选择电极法测定尿氟含量,并根据所测得的UF浓度,将调查对象分为4组:①UF1.96 mg/gCr组,140 例;② 1.96 mg/gCr ≤ UF3.92 mg/gCr组,93 例;③ 3.92mg/gCr≤UF7.84 mg/gCr组,82例;④ UF≥7.84 mg/gCr组,65例。1.4氟骨症诊断对荷花村295名调查对象进行了前臂和小腿的X线检查。并根据地方性氟骨症诊断标准对荷花村295名调查对象进行了氟骨症严重程度的评估,根据其X线表现分为:正常、轻度、中度、重度4组。1.5调查对象p16基因转录表达及甲基化水平检测实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测调查对象外周血p16基因mRNA转录;酶联免疫吸附法(ELISA)检测调查对象外周血P16蛋白表达;甲基化敏感性高分辨率溶解曲线(MS-HRM)法检测调查对象外周血p16基因启动子区甲基化水平。2人成骨细胞氟中毒体外实验研究以0、125、250、500及1000 μmol/L NaF处理人成骨细胞72 h,建立氟中毒模型。在不同的染氟剂量组中,MTT法检测人成骨细胞细胞活力;流式细胞术检测细胞周期分布;qRT-PCR检测p16基因mRNA转录;免疫印迹法(Western-blot,WB)检测P16蛋白表达;亚硫酸氢盐测序PCR法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测p16基因启动子区甲基化水平。3 DNA甲基转移酶抑制剂5-AZA-dC体外干预研究选择剂量1000 μmol/L NaF处理人成骨细胞72 h,建立氟中毒细胞模型,根据MTT结果及参考文献,以5、10及20μmol/L 5-AZA-dC继续处理细胞72 h。设阳性对照组(只染1000 μmol/L NaF)及不染毒空白对照组,建立5-AZA-dC干预模型。在不同剂量干预组中,BSP检测p16基因甲基化水平;qRT-PCR检测p16基因mRNA转录水平;WB检测P16蛋白表达;MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期分布。结果1燃煤污染型氟暴露人群研究随UF浓度增加,p16基因mRNA转录及蛋白表达逐渐降低(χ2mRNA、蛋白=22.812、45.785,P均0.05),p16基因启动子区甲基化水平逐渐增加(χ2=40.942,P0.05),同时氟骨症的严重程度也逐渐增加(χ2= 16.791,P0.05)。在此基础上,进一步分析了不同氟骨症组中p16基因表达和甲基化水平差异,发现随着氟骨症的加重,p16基因表达逐渐降低(χ2mRNA、蛋白二8.535、15.963,P均0.05),p16启动子区甲基化水平增加(χ2= 9.242,P0.05)。说明p16基因启动子区的异常甲基化与氟暴露反应有关,可能参与了氟骨症的发生发展。同时,根据所测得甲基化水平,分为3个组:0-1%、1-12.5%和12.5-75%,发现随着甲基化水平的升高,p16基因表达逐渐降低(χ2 mRNA、蛋白= 7.176、7.017,P均0.05),提示p16基因表达的下调与其甲基化有关。2人成骨细胞氟中毒体外实验研究随着染氟剂量的增加,人成骨细胞增殖指数(PI)逐渐升高(F=66.801,P0.05),处于G0/G1期细胞数逐渐减少,S期细胞逐渐增多,表明人成骨细胞在氟作用下加快了细胞进入DNA的合成阶段,表现出细胞增殖旺盛状态;随NaF剂量的增加,p16基因表达呈逐渐下降趋势(FmRNA、蛋白=41.663、49.844 P均0.05);p16基因启动子区甲基化水平呈逐渐上升趋势(χ2=73.034,P0.05)。3 DNA甲基转移酶抑制剂5-AZA-dC体外干预研究不同剂量5-AZA-dC干预组中,随着5-AZA-dC干预剂量的增加,p16基因启动子区甲基化水平呈逐渐下降趋势(χ2=97.695,P0.05),p16基因mRNA转录及蛋白表达水平呈逐渐升高趋势(FmRNA、蛋白=42.850、30.560,P均0.05)。成骨细胞活力呈逐渐降低趋势(F=40.455,P0.05),处于G0/G1期细胞数增加,而S期细胞逐渐减少,细胞增殖指数(PI)呈逐渐降低趋势(F=56.277,P0.05)。结论:1、氟暴露能够通过诱导p16基因启动子区高甲基化进而抑制了p1 基因mRNA转录和蛋白的表达,导致了成骨细胞的增殖活跃,是氟致人成骨细胞增殖活跃的分子机制之一。2、DNA甲基转移酶抑制剂5-AZA-dC能有效回复氟所致的p16基因启动子区高甲基化水平,回复p16基因的转录表达,进而逆转氟所引起的人成骨细胞增殖活跃,为氟骨症的治疗研究带来了新的思路。
【图文】：

注：与 UF<1.96mg/gCr）组比较，，*P<0.05图 1-4 不同 UF 水平 p16 基因 mRNA 转录表达4 Comparison of p16 mRNA expression in different 注：与 UF<1.96（mg/gCr）组比较，*P<0.05图 1-5 不同 UF 水平 p16 基因蛋白表达

13注：与 UF<1.96（mg/gCr）组比较，*P<0.05图 1-5 不同 UF 水平 p16 基因蛋白表达 Comparison of P16 protein expression in different 16 启动子区甲基化水平表达辨率熔解曲线分析（MS-HRM）
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R599.1

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本文编号：2677942