MicroRNA-326调节Th17细胞参与自身免疫甲状腺炎的实验研究

发布时间：2020-06-02 18:20

【摘要】：目的:自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune thyroiditis,AIT)是一种常见的自身免疫性疾病,其中桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)是AIT的主要类型。HT患者具有遗传易感性且存在受环境因素影响的免疫缺陷,表现为甲状腺内淋巴细胞浸润和滤泡组织损伤,血清中存在甲状腺的循环抗体,主要是抗甲状腺过氧化物酶抗体(Antithyroid peroxidase antibodies,TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin antibodies,TgAb),可导致甲状腺纤维化或萎缩,并伴有甲状腺功能减退症。Th17细胞是T helper(Th)细胞家族成员之一,主要分泌以IL-17a为代表的细胞因子,近年来研究发现Th17参与多种自身免疫性疾病的发生与发展,包括多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)和1型糖尿病(T1DM)等。AIT中存在Th17细胞表达异常,但其具体机制有待进一步的深入研究。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性单链非编码高度保守的小RNA分子,主要是通过与靶mRNAs的3’端非编码区结合,导致靶mRNAs降解和(或)翻译抑制,在免疫系统发育和调节机制中发挥重要作用。目前AIT的发病机制尚未明确,有关miRNAs在AIT中的研究亦较少。本研究前期已经在AIT的模型小鼠NOD.H-2h4小鼠的甲状腺和脾脏以及HT患者PBMC和甲状腺组织中发现miR-326的水平明显升高。本实验通过使用小干扰RNA抑制剂(miR-326 inhibitor)和慢病毒编码miR-326 sponge(LV-sponge)特异性抑制miR-326使miR-326水平下调后,研究在AIT中miR-326是否通过靶向调节Ets-1蛋白和ADAM17参与Th17的分化,从而减轻自身免疫甲状腺炎的发病及炎症程度,为自身免疫性甲状腺炎的发病机制及治疗研究提供新的理论基础。研究方法:1、HT患者实验研究:本研究第一部分以HT患者为研究对象,收取因甲状腺癌或结节性甲状腺肿行甲状腺手术的患者的(对侧叶或结节旁)甲状腺组织,根据其甲状腺病理结果及甲状腺功能分为桥本病组(HT组,n=24)和非桥本病对照组(n=29)。同时收取桥本病患者(n=31)及健康志愿者对照(n=23)外周血,分离PBMC及血清和血浆。检测PBMC和甲状腺组织中Ets-1 mRNA和蛋白表达水平,并将Ets-1蛋白与TPOAb、TgAb、miR-326和Th17 mRNA水平做相关性分析。2、AIT动物模型实验研究:利用siRNA和慢病毒在体外和体内分别探究了抑制miR-326后免疫细胞及炎症因子的变化。首先,体外实验中,将小鼠脾脏单个核细胞进行Th17细胞极化培养3天后,使用miR-326 inhibitor抑制miR-326,检测Th17细胞比率和IL-17水平。其次,LV-sponge和慢病毒对照(LV-ctrl)给予小鼠体内干预实验。将5周龄NOD.H-2h4小鼠分为2大组,分别为尾静脉注射组和甲状腺局部注射组。尾静脉注射组分为5小组进行干预:单纯高碘组(High iodine)、高碘治疗对照组(High iodine+the LV-ctrl)、高碘治疗组(High iodine+the LV-sponge)、高碘预防对照组(High iodine+pro LV-ctrl)和高碘预防组(High iodine+pro LV-sponge)。预防及预防对照组在小鼠5周龄开始给予碘化钠(NaI)饮水的同时行慢病毒干预,治疗与治疗对照组在小鼠5周龄开始给予NaI饮水满6周后行慢病毒干预。5组小鼠均在NaI饮水满12周时处死,留取血清和甲状腺等组织。甲状腺局部注射组分为LV-sponge和LV-ctrl两组,小鼠均在NaI饮水满10周时处死,留取血清和甲状腺等组织。检测小鼠血清TgAb水平,评价小鼠炎症状态。新鲜脾脏进行流式染色,检测T细胞、B细胞、辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc),并检测Th1、Th2、Th17、Treg亚群比例。脾脏提取总RNA,一方面检测miR-326的表达变化,用以判定抑制效果;另一方面检测Ets-1、Th17相关细胞因子(IL-17a和IL-22)、转录因子(Rorgt、Rora和Irf4等)和表面受体(CCR6和IL-23R)等。提取脾脏蛋白,检测Ets-1和ADAM17的相对表达水平。结果:1、HT患者实验研究:与对照人群相比,HT患者甲状腺组织和外周血PBMC中Ets-1 mRNA水平没有差异,而Ets-1蛋白表达明显降低,P值分别为P=0.034和P=0.009。相关性分析发现,Ets-1蛋白的相对表达与miR-326和Th17mRNA水平呈显著负相关。2、动物体外实验:与阴性对照组相比,Th17细胞比率在miR-326 inhibitor组中显著降低,培养上清中细胞因子IL-17水平亦是显著降低,(P0.05)。3、动物体内实验研究:尾静脉注射组1)与单纯高碘和高碘LV-control组相比,高碘LV-sponge组miR-326水平明显降低,说明慢病毒尾静脉干预抑制miR-326作用有效。2)5组高碘喂养12周的小鼠T细胞、B细胞、Th细胞和Tc细胞比例无差异。3)与单纯高碘和高碘LV-control组相比,高碘LV-sponge组甲状腺HE染色炎症评分和血清TgAb滴度下降明显。4)小鼠脾脏Ets-1蛋白在高碘LV-sponge组中表达升高,且在治疗组中升高明显,有统计学差异(P=0.039),而Ets-1 mRNA水平在5组中无明显差异。5)小鼠脾脏ADAM17在高碘LV-sponge组表达相对升高,而IL-23R蛋白表达则显著降低,差异具有统计学意义,(P0.05)。6)高碘喂养12周小鼠的Th1和Th2细胞比率在5组中的比例无显著差异;Treg细胞比率在高碘预防组中增加,差异有统计学意义(P=0.047);Th17细胞比率在高碘治疗组有下降趋势,在高碘预防组中显著下降(P=0.042);Th17/Treg比值在高碘预防组中显著下降(P=0.005)。Th17相关细胞因子IL-17a、IL-22,转录因子Rorgt、Rora和表面受体CCR6、IL-23R在LV-sponge中显著下降(P0.05)。4、动物体内实验:甲状腺局部注射组1)与高碘LV-control组相比,高碘LV-sponge组小鼠甲状腺HE染色炎症评分和血清TgAb滴度水平显著下降(P0.05)。2)高碘LV-control组和高碘LV-sponge组小鼠脾脏miR-326水平无明显差异(P=0.239)。结论:1、HT患者甲状腺组织和PBMC中Ets-1蛋白表达显著低于对照组,而Ets-1 mRNA水平无明显差异。Ets-1蛋白相对表达与miR-326和Th17 mRNA显著负相关,提示miR-326对Ets-1可能具有负性调节作用。2、AIT动物模型小鼠在体干预发现,miR-326在体慢病毒抑制不影响T细胞、B细胞、Th细胞和Tc细胞平衡。抑制miR-326后,小鼠血清TgAb滴度下降,Ets-1蛋白表达升高,Ets-1 mRNA水平无明显变化,且Th17细胞比率及Th17细胞相关的细胞因子、转录因子和表面受体表达下降,进一步明确了miR-326通过靶向调节Ets-1蛋白影响Th17细胞的分化参与自身免疫甲状腺炎。
【图文】：

外周血,蛋白,负相关,患者

图 1.1 甲状腺组织和外周血 PBMC 中 Ets-1 mRNA 的水平3.1.3 甲状腺组织中 Ets-1 蛋白相对表达与对照组患者相比，HT 患者甲状腺组织中 Ets-1 蛋白相对表达量降低，差异有统计学意义（P=0.034）。相关性分析发现，Ets-1 蛋白相对表达量与 miR-326 水平和 IL-17 mRNA 水平均呈显著负相关（r=-0.466，p=0.003 和 r=-0.43，p=0.007），与 TPOAb、TgAb 有负相关趋势（如图 1.2 所示）。GAPDHEts-1Control HT