人脐带间充质干细胞微泡对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞组蛋白乙酰化水平影响的研究

发布时间：2020-06-06 02:26

【摘要】：背景:表观遗传学异常所致的免疫调控紊乱参与类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)的发生、发展。组蛋白乙酰化修饰是一种在组蛋白赖氨酸残基上进行修饰的可逆的表观遗传学方式,通过组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase1,HDAC1)和HDAC2从多方面调控并参与RA发病。本课题组前期研究发现人脐带间充质干细胞来源的微泡(human umbilical cord mesenchymal stem cells derived microvesicles,hUCMSC-MVs)可改善胶原诱导关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠关节症状及影像学表现,抑制滑膜增生,下调促炎因子及趋化因子水平,且作用不弱于母体细胞。滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLSs)作为RA病理过程中的核心靶细胞,对RA的关节炎症及骨破坏起着关键作用。hUCMSC-MVs对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(Rheumatoid Arthritis fibroblast-like synoviocytes,RA FLSs)功能的影响及作用机制尚不明确。目的:通过hUCMSC-MVs与RA FLSs体外共培养,探讨hUCMSC-MVs对RA FLSs增殖、凋亡、迁移功能及HDAC1、HDAC2表达的影响,阐明hUCMSC-MVs对RA FLSs的作用及可能的机制,从表观遗传学组蛋白乙酰化角度为hUCMSC-MVs治疗RA提供实验基础。方法:1.hUCMSC-MVs的分离、鉴定:复苏hUCMSCs,培养传代后取P3-P7代,“饥饿”培养24小时,采用差速超速离心法提取上清液,获得hUCMSC-MVs,透射电镜观察其形态,并采用免疫印迹法(Western Blot)鉴定其表面分子标志物。2.OA FLSs的分离、培养和鉴定:采用胰酶消化法体外分离、培养OA FLSs,倒置显微镜下观察其形态,并通过流式细胞术测定其表面抗原CD90、CD14、CD45。3.hUCMSC-MVs与RA FLSs共培养:观察其对RA FLSs增殖、凋亡、迁移功能及HDAC1、HDAC2蛋白表达的影响。(1)实验分组:共4组,分别是OA FLSs组、RA FLSs组、曲古抑菌素A(TrichostatinA,TSA)组、hUCMSC-MVs组。(2)检测指标:⑴CCK8法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡率,划痕实验检测细胞迁移率;⑵Western Blot法测定hUCMSC-MVs干预前后RA FLSs中HDAC1、HDAC2表达的变化。结果:1.hUCMSC-MVs的分离和鉴定:透射电镜观察显示离心所得产物为一类直径介于40nm-300nm之间大小不一的囊泡状结构,Western Blot鉴定分子表面标志物,CD63、HSP70表达阳性。2.OA FLSs的分离、鉴定:倒置显微镜下观察细胞呈涡旋状分布,为长梭形、纺锤样外观。流式细胞术鉴定分子表面标志物,CD90阳性表达,CD14、CD45阴性表达。3.hUCMSC-MVs与RA FLSs体外共培养:(1)hUCMSC-MVs对RA FLSs增殖功能的影响:hUCMSC-MVs组浓度分为10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml。1)与RA空白对照组比较,浓度为10ug/ml、50ug/ml、100ug/ml的hUCMSC-MVs组RA FLSs增殖率升高,浓度为150ug/ml、200ug/ml的hUCMSC-MVs组及TSA组RA FLSs增殖率下降,差异有统计学意义(P0.001)。2)150ug/ml hUCMSC-MVs组与200ug/ml hUCMSC-MVs组FLSs增殖率无显著差异(P0.05)。3)与TSA组相比,150ug/ml hUCMSC-MVs组、200ug/ml hUCMSC-MVs组RA FLSs增殖率升高,但无显著差异(P0.05)。(2)hUCMSC-MVs对RA FLSs凋亡的影响:150 ug/ml hUCMSC-MVs组及TSA组FLSs凋亡率高于RA空白对照组,差异具有显著性(P0.05)。与TSA组相比,hUCMSC-MVs组RA FLSs凋亡率升高,但无显著差异(P0.05)。(3)hUCMSC-MVs对RA FLSs迁移功能的影响:在12h、24h时,150 ug/ml hUCMSC-MVs干预组及TSA组RA FLSs迁移率低于RA空白对照组,差异具有显著性(P0.05)。hUCMSC-MVs组RA FLSs迁移率高于TSA组,但无显著差异(P0.05)。(4)hUCMSC-MVs对RA FLSs中HDAC1、HDAC2蛋白表达的影响:RA FLSs组HDAC1、HDAC2蛋白表达均高于OA FLSs组,差异具有显著性(P0.05);与RA FLSs组相比,hUCMSC-MVs组HDAC1蛋白表达下降(P0.05),且作用不弱于TSA组。结论:hUCMSC-MVs可抑制RA FLSs的增殖、迁移能力,促进其凋亡;HDAC1和HDAC2参与RA的发病;hUCMSC-MVs可下调RA FLSs中HDAC1的表达,从组蛋白乙酰化角度抑制RA的发病。
【图文】：

（2）Western Blot 检测 hUCMSC-MVs 表面分子标志物的蛋白表达，，结果显示CD63、HSP70 呈阳性表达（见图 3B）。图3A hUCMSC-MVs透射电镜图图3B Western Blot鉴定分子表面标志物图CD63、HSP70 表达阳性

CD63、HSP70 呈阳性表达（见图 3B）。图3A hUCMSC-MVs透射电镜图图3B Western Blot鉴定分子表面标志物图CD63、HSP70 表达阳性
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.22

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本文编号：2699002