多米尼加人群系统性红斑狼疮遗传易感基因位点分析及抗14-3-3 eta抗体在狼疮肾炎发病中作用研究

发布时间：2020-06-06 22:32

【摘要】：目的:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种复杂的自身免疫疾病,具有较强的遗传倾向,因此,其患病率和疾病特征性标记在不同种族存在较大差异。SLE同卵双胞胎和一级亲属的患病风险为30~50%,是一般人群的20倍。在多米尼加共和国(Dominican Republic,DR)人群中,SLE的发病率和疾病的严重程度都显著高于其他人群。迄今为止,有关多米尼加共和国人群SLE遗传风险因素的研究未见报道。SLE是过量的自身抗体及免疫复合物(immune complexes,ICs)沉积于组织所致。狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)是SLE患者最常见的并发症之一,在SLE患者中的发病率约60%,其中,自身抗体是主要致病因素之一。尽管已经确认了多种SLE相关自身抗体,但至今仍未发现与SLE肾损害相关的自身抗体。本研究通过单核苷酸多态性分析鉴定多米尼加共和国人群中SLE的遗传易感基因SNP,并通过相关分子生物学技术鉴定与SLE和LN疾病活动期相关的抗肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)组分的自身抗体,评估该自身抗体与LN、SLE活动期的相关性以及对MC凋亡的影响,为进一步研究其在LN发病机理提供科学依据。研究方法:一、实验材料1、研究对象:SLE、骨关节炎(osteoarthritis,OA)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者和健康对照者来自于美国内布拉斯加州大学医学中心(University of Nebraska Medical Center,UNMC,Omaha,NE)、多米尼加共和国天主教大学(the Pontificia Universidad Católica Madre y Maestra PUCMM,Santiago De Los Caballeros,Dominican Republic)。SLE患者、狼疮肾炎患者均符合美国风湿病学会(American College of Rheumatology,ACR)相关国际分类标准。患者和健康者血清样品均经机构审查委员会审定,并经本人知情同意后采集。2、细胞系:肾小球系膜细胞(American Type Culture Collection,ATCC,Manassas,VA,美国)。3、抗体:抗14-3-3 eta山羊多克隆抗体购自Santa Cruz生物技术公司(Dallas,TX,美国);FITC标记的驴抗人IgG、过氧化物酶标记的驴抗人IgG以及过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG均购自美国Jackson免疫研究所。二、实验方法1、基因型检测:采用Sequenom’s MassARRAY IPLEX基因分型技术分析单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)2、重组抗体的制备:应用单细胞PCR技术制备重组抗体3、细胞培养4、流式细胞仪筛选可与肾小球系膜细胞结合的重组抗体5、竞争实验6、凋亡检测7、免疫沉淀检测8、质谱测定9、Western blot检测10、酶联免疫吸附试验11、统计学分析实验结果:1、SNP分析结果表明,在SLE患者38个候选SNP中,9个非HLA基因(分别为ITGAM、BLK、TNFSF4、PTPN22、TNIP1、STAT4、CARD11和TNXB TNFAIP3);6个HLA基因(分别为HLA-DQA1、HLA-DRB2、HLA-DRA、HLA-DQA2、HLA-DRB1、HLA-DQB1)的19个SNP分布与对照组存在显著性差异。HLA-DRA单体型A-T与LN有关且这种单体型在LN中存在基因剂量效应。ITGAM的纯合基因型“AA”与多米尼加人群LN显著相关。HLA-DQA2rs2301271和TNFSF4 rs2205960中的“T”等位基因与NPSLE显著相关且这两个等位基因都有明显的基因剂量效应。2、经流式细胞仪检测,利用单细胞RT-PCR技术合成的334个SLE重组抗体中有16个可与肾小球系膜细胞结合。3、应用免疫沉淀结合质谱技术,从MC膜蛋白提取物中鉴定出三个可与16个MC特异结合的重组抗体结合蛋白质,分别是基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白多糖(basement membrane-specific heparan sulfate proteoglycan core protein,HSPG)、氨酰tRNA合成酶复合多功能相互作用蛋白1(aminoacyltRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 1,AIMP1)和14-3-3eta。4、ELISA检测结果显示,16个可与MC结合的SLE重组抗体中,有5个(S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9)可与14-3-3 eta蛋白结合,且吸光度值随抗体浓度增加而增加,呈剂量依赖方式。5、Western blot检测结果表明16个可与MC结合的SLE重组抗体中,有5个(S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9)可与14-3-3 eta蛋白特异性结合。6、竞争实验结果显示,5个重组抗体(S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9)与过量14-3-3 eta蛋白共同孵育后其与MC的反应性部分或完全消失,表明14-3-3 eta介导或部分介导抗体与MC的结合。7、应用ELISA方法检测SLE组和健康对照组血清抗14-3-3 eta抗体滴度,结果显示,不同地区SLE患者血清抗体水平较对照组均显著升高(P0.0001,P=0.0003)。骨关节炎(osteoarthritis,OA)和类风湿性关节炎患者血清抗14-3-3 eta抗体水平相似(P=0.8756),均显著高于健康对照组(P=0.0012,P=0.0013),且均显著低于SLE组(P=0.0027,P=0.0057)。SLE患者中,活动性肾炎组的抗体水平显著高于无活动性肾炎组(P0.0001)。SLE患者中,抗14-3-3 eta抗体阳性者,其活动性肾炎发病率显著高于抗体阴性者(P0.0001)。8、凋亡检测结果显示,用SLE来源的5个重组抗体(S3P1D11,S3P1F3,S3P1G9,S12P2D4和S12P2H9)或商品化抗体处理MC后,抗14-3-3 eta抗体使MC凋亡率下降,提示抗14-3-3 eta抗体可能通过诱导MC凋亡最终导致LN的发生。结论:1、在多米尼加人群中发现ITGAM、BLK、TNFSF4、PTPN22、TNIP1、STAT4、CARD11、TNXB TNFAIP3、HLA-DQA1、HLA-DRB2、HLA-DRA、HLA-DQA2、HLA-DRB1、HLA-DQB1基因的19个SNP为SLE易感SNP。同时,发现LN发病相关的高风险性单体型HLA-DRA rs6937545-rs7763262,确定了HLA-DRA2和TNFSF4基因中的等位基因是NPSLE发生的遗传危险因素。2、14-3-3 eta、HSPG和AIMP1是SLE的潜在自身抗原。3、抗14-3-3 eta抗体具有抑制肾小球系膜细胞凋亡的功能。4、抗14-3-3 eta抗体可能是LN和SLE疾病活动性判定的新的生物标志物。
【图文】：

实验验证,阳性对照,抗体

图2 ELISA实验验证SLE重组抗体与14-3-3 eta 蛋白的结合与阴性对照相比，，5个SLE重组抗体与14-3-3 eta 蛋白的反应呈剂量依赖14-3-3 eta1 2 3 4 5 6 7 8图3 Western blot实验验证SLE重组抗体与14-3-3 eta 蛋白的结合1. 阴性对照：只加二抗；2. 阴性对照：健康者的重组抗体；3. 阳性对照：商品化的羊抗14-3-3eta抗体；4. S3P1D11；5. S3P1F3；6. S3P1G9；7. S12P2D4；8. S12P2H9

抗体水平,检测结果,患者,抗体滴度

图5 SLE患者抗14-3-3 eta 抗体水平检测结果A. UNMC来源血清抗14-3-3 eta抗体水平检测结果；B. PUCMM来源血清抗14-3-3 eta抗体水平检测结果。由于14-3-3 eta被认为是类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)的生物标志物，为排除类风湿性关节炎及其他关节炎可能造成的干扰，我们还检测了骨关节炎(osteoarthritis，OA)和RA患者血清抗14-3-3 eta 抗体滴度。如图6所示，OA组血清抗14-3-3 eta抗体滴度均值为0.5416 (n=331, 95% CI: 0.4951-0.5881), RA组均值0.5598 (n=287，95% CI: 0.4964-0.6233), 二者水平近似，无显著差异 (P=0.8756)。但OA组和RA组抗14-3-3 eta 抗体滴度均显著高于健康对照组(OA: P=0.0012；RA：P=0.0013)，且均显著低于SLE组 (OA：P=0.0027；RA：P=0.0057)。对照组 SLE 组对照组 SLE 组
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.241

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