miR-143-3p对类风湿关节炎滑膜细胞生物学行为的调控及机制研究

发布时间：2020-06-08 00:32

【摘要】：研究背景和目的类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是骨科和风湿免疫科的常见疾病,可发于任何年龄,尤以青壮年为高发人群,女性发病率明显高于男性;RA是一种慢性、全身性自身免疫病,临床以侵蚀性关节结构破坏和慢性滑膜炎症为主要特征,主要表现为对称性、进行性多关节慢性炎症;早期多以双手、腕等小关节多见,中后期可累及膝、髋等大关节,导致关节肿痛、畸形、活动不利,类风湿性关节炎的病理特点为滑膜细胞广泛增生,新生血管形成血管翳,当病变侵犯累及滑膜下软骨和骨组织时会造成关节破坏和功能丧失。病程久者可导致心肺肾等脏器及神经系统受累,类风湿性关节炎病程长,迁延不愈,目前尚无有效方法彻底治愈,病人不得不承受几十年病痛的折磨,疾病进展到后期致残率高,对人类的生命健康和生活质量造成巨大威胁。RA的发病原因一直不明,其发病机制是一个多环节、多因素参与的复杂过程,有学者提出可能是外来抗原或自身潜在的抗原变异后,刺激滑膜组织中的原始免疫细胞、成纤维样滑膜细胞等诱发滑膜组织炎症反应,这种炎性反应是一过性可逆的;但是对于有一些有RA家族遗传易感背景的病人,当其接触一些容易诱发类风湿性关节炎的因素后,会使个体对自身抗原免疫耐受缺失,诱导产生针对自身抗原的获得性免疫反应,使炎症反应持续并衍化为慢性病程。过去十几年间虽然研究者们对于RA发病机制研究已经深入到细胞、分子、甚至基因水平,也取得了一定的进展,大量RA相关基因或致病因素的发现,使RA在治疗方法上取得了不断进步,在一定程度上控制了RA的发生和发展,使患者生活质量得到一定改善。然而目前关于RA的病因仍未阐明,这为寻找特异性治疗手段带来困难,继续探究RA的发病机制尤为重要。研究表明,关节滑膜组织过度增生是RA始动环节,也是贯穿类风湿性关节炎疾病进程的主要特征之一,滑膜细胞过度活化增殖是滑膜组织增生的主要原因,这种增殖即便在脱离了炎性环境的无刺激因子干预下仍能持续。关于滑膜细胞异常增殖的机制,目前认为主要涉及增殖活跃和凋亡抑制两个方面。系统地研究调控滑膜细胞过度增殖和凋亡抑制的机制,对于阐明类风湿性关节炎的病因,寻找有效的治疗方法有重要价值。表观遗传学是遗传学的一门分支学科,非编码RNA调控的靶基因修饰属于广义表观遗传学范畴,其中微小RNA是目前研究最多的一类非编码RNA。我们在前期实验中发现miR-143-3p在类风湿性关节炎患者滑膜组织高表达,提示我们miR-143-3p很可能与类风湿性关节炎有关。通过预测发现胰岛素样生长因子1受体(IGFIR)和胰岛素样生长因子5(IGFBP5)是miR-143-3p的下游靶基因。目前尚未见胰岛素样生长因子1受体或胰岛素样生长因子5与滑膜细胞增殖和凋亡的相关报道。本研究拟以此为切入点,深入研究miR-143-3p与IGFIR和IGFBP5的关系的表达,以及miR-143-3p调控滑膜细胞增殖和细胞凋亡的机制阐明其从而在类风湿性关节炎滑膜组织增生中发挥作用。RAS-MAPKs是类风湿性关节炎中研究较多的一类信号通路,它主要由TNF-a与细胞膜表面受体结合后诱导活化,其引起的滑膜细胞信号传导异常是类风湿性关节炎的重要机制之一。RAS-MAPKs与TNF-a之间形成正反馈调控,引起持续性炎症反应,针对p38 MAPK信号通路的类风湿性关节炎靶向治疗在未来非常有前景。本研究还欲探索tmiR-143-3p对类风湿性关节炎滑膜细胞Ras/p-p38/p38表达的影响,研究miR-143-3p与Ras-p38 MAPK信号通路的关系,为深入探索类风湿性关节炎中miR-143-3p对Ras-p38 MAPK通路的调控机制提供前期研究基础。研究方法1.定量PCR检测miR-143-3p在类风湿性关节炎患者的滑膜组织和TNF-α诱导的类风湿性关节炎滑膜细胞中的表达,验证预实验的结果;接下来在细胞系中转染miR-143-3p抑制剂(inhibitor),MTT法和流式细胞术检测miR-143-3p低表达对类风湿性关节炎滑膜细胞增殖和凋亡的影响,并定量PCR和Western Blot检测与细胞增殖和凋亡有关的Bcl-2、Bax、Pro-casepase-3和Active caspase-3基因和蛋白表达情况。2.构建双荧光素酶报告基因检测miR-143-3p与下游靶基因胰岛素样生长因子1受体和胰岛素样生长因子5是否存在相互作用;定量PCR和Western blot检测类风湿性关节炎滑膜细胞中胰岛素样生长因子1受体和胰岛素样生长因子5的表达情况;分析miR-143-3p与胰岛素样生长因子1受体和胰岛素样生长因子5表达水平的相关性。3.在细胞系中转染miR-143-3p抑制剂/类似物(inhibitor/mimic),定量PCR和Western blot检测类风湿性关节炎滑膜细胞中miR-143-3p低表达对靶基因胰岛素样生长因子1受体和胰岛素样生长因子5表达的影响;将miR-143-3p inhibitor分别与针对胰岛素样生长因子1受体或胰岛素样生长因子5的siRNA共转染滑膜细胞,检测滑膜细胞的凋亡和增殖的变化。4.在细胞系中转染 miR-143-3p inhibitor,定量 PCR 和 Western blot 检测 Ras、p-p38、p38的表达,观察miR-143-3p对类风湿性关节炎滑膜细胞Ras/p-p38 MAPKs通路的影响。研究结果1.类风湿性关节炎患者滑膜组织中miR-143-3p mRNA表达水平是正常人滑膜组织的3.23倍(p0.05),骨关节炎患者与正常人滑膜组织中miR-143-3pmRNA表达水平无显著差异(p0.05);TNF-α诱导的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞中miR-143-3p mRNA表达水平是正常成纤维滑膜细胞的2.91倍(p0.01)。2.转染miR-143-3p后第24、48、72和96hr TNF-α诱导的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞存活率(OD570)分别为0.51、0.55、0.76和0.93;转入Inhibitor NC的细胞存活率分别为0.51、0.80、0.95和1.45;Control组细胞存活率分别为0.50、0.78、0.99 和 1.47,miR-143-3p 组细胞存活率较 Control 组和 Inhibitor NC组明显降低(p0.05)。3.转染miR-143-3p的TNF-α诱导类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞凋亡率为(13.56±2.33)%,转染miR-143-3pNC的RA成纤维滑膜细胞凋亡率为(7.48±2.01)%,Control组细胞凋亡率为(6.11±1.01)%,miR-143-3p组凋亡率较Inhibitor NC组和Control组显著增高(p0.01)。4.转染miR-143-3p的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞Bcl-2、pro-caspase-3 mRNA 和蛋白水平较 Control 组显著降低(p0.01),Bax、Active caspase-3 mRNA和蛋白水平较Control组显著升高(p0.01)。转入inhibitor NC的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞较对照组Bcl-2、Bax、casepase-3表达无显著差异(p0.05)。5.荧光素酶报告基因检测显示miR-143-3p mimic和胰岛素样生长因子1受体/胰岛素样生长因子5基因的3'-UTR野生型重组报告质粒共转染后的荧光素酶活性显著降低,说明胰岛素样生长因子1受体/胰岛素样生长因子5是miR-143-3p的靶基因。6.TNF-α诱导的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞胰岛素样生长因子1受体/胰岛素样生长因子5 mRNA和蛋白水平较正常成纤维滑膜细胞显著降低(p0.01)。miR-143-3p与胰岛素样生长因子1受体/胰岛素样生长因子5表达水平均呈负相关,r2分别为0.6359和0.5876,p0.001。7.miR-143-3p inhibitor组类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞胰岛素样生长因子1受体/胰岛素样生长因子5 mRNA和蛋白表达水平较Control组明显升高(p0.05);miR-143-3p mimic组的RA成纤维滑膜细胞胰岛素样生长因子1受体/胰岛素样生长因子5 mRNA表达水平较Control组明显降低(p0.05,p0.01)。8.转入针对胰岛素样生长因子 1 受体(Insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)或胰岛素样生长因子5(Insulin-like growth factor 5,IGFBP5)的siRNA的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞存活率均显著高于si-NC组(p0.05)。转染miR-143-3p inhibitor的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞存活率显著低于Inhibitor NC 组(p0.05)。miR-143-3p inhibitor 和 si-IGFIR 或 si-IGFBP5 共转染后细胞存活率分别较si-IGFIR组和si-IGFBP5显著降低(p0.05)。9.转染si-IGFIR或si-IGFBP5的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞凋亡率显著低于si-NC组细胞(p0.05)。转染miR-143-3p inhibitor的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞细胞凋亡率显著高于Inhibitor NC组(p0.05)XmiR-143-3p inhibitor和si-IGFIR或si-IGFBP5共转染后细胞凋亡率分别较si-IGFIR组和si-IGFBP5显著升高(p0.05)。10.类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞较正常滑膜细胞的Ras、p-p38mRNA水平均显著升高(**p0.01),miR-143-3p inhibitor处理后类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞Ras.p-p38mRNA水平均明显降低(**p0.01)。11.类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞较正常滑膜细胞的Ras、p-p38蛋白水平显著升高,p38蛋白水平降低;miR-143-3p inhibitor处理后类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞Ras、p-p38蛋白水平明显降低,p38蛋白水平升高。研究结论1.miR-143-3p是一个类风湿性关节炎致病因子,在RA滑膜细胞中高表达;抑制miR-143-3p能抑制RA成纤维滑膜细胞的增殖,促进细胞凋亡;2.胰岛素样生长因子1受体/胰岛素样生长因子5是miR-143-3p的两个下游靶基因,在类风湿性关节炎滑膜细胞中低表达,且与miR-143-3p呈负相关性;3.miR-143-3p inhibitor能上调胰岛素样生长因子1受体/胰岛素样生长因子5的表达,部分逆转si-IGFIR和si-IGFBP5引起的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞过度增殖和凋亡抑制,对类风湿性关节炎起保护作用;4.miR-143-3p inhibitor能抑制类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞的Ras/p38 MAPK信号通路。
【图文】：

滑膜组织,滑膜细胞,患者,正常人

达逡逑分别以正常人的滑膜组织和未处理的成纤维滑膜细胞系ＭＨ７Ａ为对照组，以逡逑ＧＡＰＤＨ为内参基因，由图１可见，ＲＡ患者滑膜组织中ｍｉＲ－１４３－３ｐｍＲＮＡ表达逡逑水平较正常人显著升高，是正常人滑膜组织的３．２３倍（ｐ＜０．０１）邋；邋ＯＡ患者滑膜逡逑组织中ｍｉＲ－１４３－３ｐ邋ｍＲＮＡ表达水平较正常人滑膜组织无显著差异（Ｐ＞0．0５）；逡逑ＴＮＦ－ｃｘ诱导的ＭＨ７Ａ细胞中ｍｉＲ－１４３－３ｐ邋ｍＲＮＡ表达水平较未处理ＭＨ７Ａ细胞显逡逑著升高（ｐ＜0．0５），是未处理ＭＨ７Ａ细胞的２．９１倍。逡逑—４１逦Ａ逡逑§逦？？逦0逦Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑—逦Ｓ逦ＴＮＦ－ａ逡逑？３－逦异邋３－逦－ｒ￣逡逑３逦ｓ逡逑Ｖ逦ｎｓ逦Ｉ２＇逡逑！逦逦邋ｒ－逡逑Ａ逦Ｂ逡逑图１邋ＲＡ患者滑膜组织和？Ｆ－ｃｃ诱导ＲＡ成纤维滑膜细胞中逡逑ｍｉＲ－１４３－３ｐ邋ｍＲＮＡ邋水平逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｍｉＲ－１４３－３ｐ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ｓｙｎｏｖｉａｌ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｏｆ邋ＲＡ邋ｐａｔｉｅｎｔｓ邋ａｎｄ逡逑ＴＮＦ－ａ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＲＡ邋ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ邋ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅｓ逡逑Ａ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ：正常人滑膜组织；ＯＡ：骨关节炎患者滑膜组织；ＲＡ：类风湿性关逡逑节炎患者滑膜组织；Ｂ：邋Ｃｏｎｔｒｏｌ：正常成纤维滑膜细胞系，ＴＮＦ－ａ：邋ＴＮＦ－ｃｘ诱导逡逑的ＲＡ成纤维滑膜细胞系；＊ｐ＜０．０５，邋＊＊ｐ＜０．０１逡逑３９逡逑

滑膜细胞,活化的,前体

３．１．５低表达ｍｉＲ－１４３－３ｐ对ＲＡ成纤维滑膜细胞Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、ｃａｓｅｐａｓｅ，３表达的逡逑影响逡逑由图５Ａ和５Ｂ可见低表达ｍｉＲ－１４３－３ｐ后，ＲＡ成纤维滑膜细胞Ｂｃｌ－２邋ｍＲＮＡ逡逑和蛋白水平较Ｃｏｎｔｒｏｌ组显著降低（ｐ＜０．０１邋），Ｂａｘ邋ｍＲＮＡ和蛋白水平较Ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑组显著升高（ｐ＜０．０１邋），ｃａｓｅｐａｓｅ－３前体ｍＲＮＡ和蛋白水平较Ｃｏｎｔｒｏｌ组显著降低逡逑（ｐ＜０．０１邋），活化的ｃａｓｅｐａｓｅ－３邋ｍＲＮＡ和蛋白水平较Ｃｏｎｔｒｏｌ组显著升高（ｐ＜０．０１）。逡逑转入ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＮＣ的ＲＡ成纤维滑膜细胞较对照组Ｂｃｌ－２、Ｂａｘ、ｃａｓｅｐａｓｅ－３表达无逡逑显著差异（ｐ＞0．0５）。逡逑４２逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.22

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