原硅酸体外通过非经典BMP通路影响骨分化机制的研究

发布时间：2020-06-10 18:13

【摘要】：研究背景骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种以骨量低下,骨微结构破坏,导致骨脆性增加而易发生骨折为特征的全身性骨骼疾病。机体在发生骨质疏松的过程中,骨形成和骨吸收之间的动态平衡发生紊乱,并逐渐形成恶性循环,致使骨折易感性明显增加。同时,骨质疏松症作为一种退化性疾病,其发病率同增龄密切相关,随着人类寿命延长和人口老龄化的加剧,骨质疏松症已成为人类面临的严要公共健康问题。因此,针对骨质疏松及其并发症治疗方法的研究成为当前研究的重点。硅元素作为人体内重要的必需微量元素,其与骨质疏松症的发生发展密切相关。硅元素可能同维生素D的作用一样,能够显著提高骨矿化的速度。既往研究发现饮食中缺乏硅元素易导致骨骼发育异常而出现骨密度下降。因原硅酸(Orthosilicic Acid)具有低分子量和良好水溶性的特点,所以原硅酸是目前发现的最适合被人类和动物吸收的硅元素形式。近期有相关研究证实骨形态发生蛋白(BMP)在原硅酸介导的成骨分化过程中发挥了重要作用,但是否存在其它非经典BMP通路参与原硅酸介导的骨分化过程目前尚未完全阐明。既往研究多次证实PI3K-Akt-mTOR信号通路对成骨分化过程具有正向调节的作用。然而当前的骨分化研究领域中尚未出现关于原硅酸介导的成骨分化过程同PI3K-Akt-mTOR信号通路之间关系的研究。因此,本研究主要内容为原硅酸分别作用于脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)和人成骨样细胞(MG-63和U2-OS)后检测相关成骨指标和PI3K-Akt-mTOR信号通路的表达变化,探究原硅酸对ADMSCs和人成骨样细胞骨分化的影响及其同PI3K-Akt-mTOR信号通路之间的关系。同时,因ADMSCs具有多向分化的潜能,本研究进一步检测了原硅酸作用于ADMSCs后与破骨分化密切相关的RANKL/OPG信号通路的变化,探究原硅酸对ADMSCs在破骨分化方面的作用机制。本研究的创新点:1.首次探究原硅酸作用于脂肪间充质干细胞和人成骨样细胞后其骨分化作用和PI3K-Akt-mTOR信号通路之间的关系;2.首次将原硅酸作用于脂肪间充质干细胞,并从成骨分化和破骨分化两方面探究原硅酸在骨分化过程中的作用机制。本研究结果将为原硅酸和ADMSCs联合应用于骨质疏松及并发症的治疗提供线索,同时为原硅酸用于骨质疏松症的治疗提供新的理论依据。第一部分原硅酸体外通过PI3K-Akt-mTOR通路和RANKL/OPG通路影响脂肪间充质干细胞骨分化机制的研究研究目的(1)检测原硅酸对ADMSCs的细胞活性的影响。(2)检测原硅酸对ADMSCs骨分化的影响。(3)探究原硅酸影响ADMSCs骨分化过程中可能存在的作用机制。研究方法(1)为验证所购买ADMSCs的稳定性,取第6代生长状态良好的ADMSCs应用茜素红S染色及油红O染色鉴定其成骨及成脂分化能力;同时,应用流式细胞术鉴定第6代ADMSCs表面特异性标志物。(2)应用不同浓度原硅酸作用于ADMSCs 1d、3d、5d、7d后,用CCK-8法检测ADMSCs的细胞活性。(3)应用Wstern blot技术检测不同浓度原硅酸作用于ADMSCs 7d后相关成骨分化指标(COL1和RUNX2)的变化情况,分析COL1和RUNX2的表达同原硅酸作用浓度之间的关系,并从中探索最适诱导ADMSCs成骨分化的原硅酸浓度。(4)应用茜素红S染色方法检测原硅酸作用于ADMSCs 28d后钙结节的生成情况。(5)应用Wstern blot技术检测不同浓度原硅酸作用于ADMSCs 7d后PI3K-Akt-mTOR信号通路的变化,并分析其变化同原硅酸作用浓度之间的关系。(6)应用细胞免疫荧光技术检测原硅酸作用于 ADMSCs 7d后细胞内P-Ak t和P-mTOR表达情况,进一步验证原硅酸对PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响。(7)根据有无原硅酸和PI3K抑制剂LY294002,将细胞分为如下4组:对照组,对照+LY294002组,原硅酸组,原硅酸+LY294002组。应用Wstern blot技术检测4组中PI3K-Akt-mTOR信号通路和成骨分化指标(COL1、RUNX2)的表达,分析原硅酸介导的ADMSCs成骨分化同PI3K-Akt-mTOR信号通路之间的关系。(8)按上述分组,应用BCIP/NBT碱性磷酸酶(ALP)显色法,检测原硅酸和LY294002对成骨分化指标ALP表达的影响,进一步探究原硅酸介导的ADMSCs成骨分化同PI3K-Akt-mTOR信号通路之间的关系。(9)应用Wstern blot技术检测不同浓度原硅酸作用于ADMSCs 7d后RANKL和OPG的表达,分析RANKL和OPG的表达同原硅酸作用浓度的关系并从中根据RANKL/OPG的比值探索最佳抑制ADMSCs向破骨分化的原硅酸浓度。(10)根据有无活性蛋白sRANKL和原硅酸将细胞分为如下3组:对照组,sRANKL组,sRANKL+原硅酸组。应用Wstern blot技术检测相关破骨分化指标(NFATc1、CALCR、CTSK)的表达,分析原硅酸在sRANKL介导的ADMSCs破骨分化过程中所起的作用。(11)按上述分组,应用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色法检查原硅酸和sRANKL对破骨分化指标TRACP表达的影响,进一步分析原硅酸在sRANKL介导的ADMSCs破骨分化过程中所起的作用。实验结果(1)第6代ADMSCs经成骨和成脂诱导后,两种染色结果均为阳性;同时经流式细胞术对其细胞表面特异蛋白鉴定,结果示CD90阳性率大于90%,CD45和CD11阳性率均小于5%。表明ADMSCs具有成骨和成脂分化的能力,同时具备间充质干细胞的表面特征。(2)ADMSCs的细胞活性未随着原硅酸的作用浓度和时间的变化而变化。表明原硅酸(≤40 μM)对ADMSCs的细胞活性无明显影响。(3)原硅酸能够上调COL1和RUNX2的表达。当原硅酸浓度为20 μM时,COL1和RUNX2的上调均最显著,可作为最适诱导ADMSCs成骨分化的原硅酸浓度。(4)原硅酸(20 μM)作用ADMSCs 28d后,能显著促进钙结节的生成。(5)原硅酸能够上调PI3K、P-Akt、P-mTOR的表达。当原硅酸浓度为20 μM时,P-Akt的上调最显著。而总Akt和总mTOR的表达未随着原硅酸的浓度变化而出现显著变化。(6)原硅酸能显著提高P-Akt和P-mTOR的荧光阳性细胞数和荧光强度。此结果同Wstern blot结果趋势一致。(7)原硅酸能够上调PI3K、P-Akt、P-mTOR、COL1和RUNX2的表达,当加用PI3K抑制剂LY294002后,上述蛋白的表达均呈现下调。表明PI3K-Akt-mTOR信号通路被抑制后,原硅酸对ADMSCs的成骨分化作用也被抑制。(8)原硅酸能够增加ALP的表达,当加用LY294002后ALP的表达被抑制。此结果同其它成骨分化指标(COL1和RUNX2)的结果趋势一致。再次证实PI3K-Akt-mTOR信号通路在原硅酸介导的ADMSCs成骨分化过程中起到正向调节作用。(9)原硅酸能够下调RANKL和上调OPG的表达。此结果表明原硅酸通过降低RANKL/OPG的比值,抑制ADMSCs向破骨分化。当原硅酸浓度为20 u M时RANKL/OPG的比值最低,此浓度可作为抑制ADMSCs向破骨分化的最适浓度。(10)sRANKL能够上调破骨分化指标NFATc1、CALCR、CTSK的表达,当加用原硅酸一同作用后,上述指标的表达均出现下调。表明原硅酸能够抑制sRANKL介导的ADMSCs破骨分化过程。(11)sRANKL能够使TRACP染色阳性反应增强且阳性细胞数增加,当加用原硅酸一同作用后,TRACP染色阳性反应减弱且阳性细胞数减少。本结果再次验证原硅酸能够抑制sRANKL介导的破骨分化过程。实验结论(1)原硅酸(≤40 μM)对ADMSCs的细胞活性无明显影响。(2)原硅酸能够上调成骨分化指标(RUNX2、COL1和ALP)的表达,促使ADMSCs向成骨分化。(3)原硅酸在促进ADMSCs成骨分化过程中能够激活PI3K-Akt-mTOR信号通路。当此通路被抑制时成骨分化过程亦被抑制,说明PI3K-Akt-mTOR信号通路在原硅酸介导的ADMSCs成骨分化过程中发挥了正向调节作用。(4)原硅酸能够下调RANKL和上调OPG的表达,降低RANKL/OPG的比值,抑制ADMSCs向破骨分化。(5)原硅酸能够抑制活性蛋白sRANKL介导的ADMSCs向破骨分化,使相关破骨分化指标(NFATc1、CALCR,CTSK和TRACP)的表达下调。此结果更进一步表明,原硅酸不仅能够降低RANKL的表达,而且能够抑制RANKL介导的破骨分化作用。第二部分原硅酸体外通过P13K-Akt-mTOR通路促进人成骨样细胞成骨及其机制的研究研究目的(1)检测原硅酸对两种人成骨样细胞(MG-63和U2-OS)的细胞活性的影响。(2)检测原硅酸对人成骨样细胞的成骨作用。(3)探究原硅酸介导的成骨过程中同PI3K-Akt-mTOR信号通路之间的关系。研究方法(1)应用不同浓度原硅酸分别作用于MG-63和U2-OS 72h,用CCK-8方法检测细胞活性。(2)应用Wstern blot技术检测不同浓度原硅酸作用于MG-63和U2-OS 72h后成骨指标(COL1和RUNX2)的变化情况,分析COL1和RUNX2的表达同原硅酸浓度的关系并从中探索最适促进两种人成骨样细胞成骨的原硅酸浓度。(3)应用细胞免疫荧光技术检测原硅酸作用于MG-63和U2-OS 72h后细胞内P-Akt和P-mTOR表达情况,探究原硅酸对PI3K-Akt-mTOR信号通路的影响。(4)根据有无原硅酸和LY294002将细胞分为如下4组:对照组,对照+LY294002组,原硅酸组,原硅酸+LY294002组。应用Wstern blot技术检测4组中PI3K-Akt-mTOR信号通路和成骨指标(COL1和RUNX2)的表达,分析原硅酸介导的成骨过程同PI3K-Akt-mmTOR信号通路之间的关系。(5)按上述分组,应用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色法检测原硅酸和LY294002对成骨指标ALP表达的影响,分析其同PI3K-Akt-mTOR信号通路之间的关系。(6)按上述分组,应用碱性磷酸酶微量酶标法进一步检测原硅酸和LY294002对ALP活性的影响,探寻原硅酸长时间作用7d后,ALP的活性同PI3K-Akt-mTOR信号通路之间的关系。(7)按上述分组,应用酶联免疫吸附实验检测细胞上清液中原硅酸和LY294002对OCN和P1NP表达的影响,进一步检测原硅酸成骨过程中OCN和P1NP的表达同PI3K-Akt-mTOR信号通路之间的关系。实验结果(1)MG-63和U2-OS的细胞活性未随着原硅酸浓度变化而变化。表明72h内原硅酸(浓度≤40 μM)对MG-63和U2-OS的细胞活性均无明显影响。(2)原硅酸能上调COL1和RUNX2的表达。当原硅酸浓度为10 μM时,COL1和RUNX2的上调均最显著,可作为最适促进成骨的原硅酸浓度。(3)原硅酸能显著提高MG-63和U2-OS中P-Akt和P-mTOR的荧光阳性细胞数和荧光强度。(4)原硅酸能够使PI3K、P-Akt、P-mTOR、COL1和RUNX2的表达均上调,加用LY294002后上述蛋白的表达均下调。表明PI3K-Akt-mTOR信号通路在原硅酸介导的成骨过程中起到正向调节作用。(5)原硅酸作用MG-63和U2-OS 72h后ALP的表达均增加,加用LY294002后ALP的表达被抑制。此结果同COL1和RUNX2的表达趋势一致。进一步验证原硅酸介导的成骨过程中,PI3K-Akt-mTOR信号通路起到了积极作用。(6)原硅酸长时间作用MG-63和U2-OS 7d后ALP的活性增强,加用LY294002后ALP的活性减弱。在原硅酸分别作用72h和7d后,ALP的表达趋势一致,这体现出ALP是成骨早期和中期的重要指标,说明PI3K-Akt-mTOR信号通路在原硅酸介导的成骨早期和中期均发挥了积极作用。(7)原硅酸能够使分泌蛋白OCN和P1NP的表达升高,加用LY294002后OCN和P1NP的表达均降低。P1NP作为COL1合成前期的分解产物,同COL1的表达趋势一致。此结果进一步表明PI3K-Akt-mTOR信号通路在原硅酸介导的成骨过程中发挥了重要作用。实验结论(1)原硅酸(≤40 μ M)作用人成骨样细胞(MG-63和U2-OS)72h,对细胞活性无明显影响。(2)原硅酸能够促进成骨指标(RUNX2、COL1、ALP、OCN和P1NP)的表达,对成骨过程发挥积极作用。(3)原硅酸在促进成骨过程中能够激活PI3K-Akt-mTOR信号通路。(4)PI3K-Akt-mTOR信号通路参与了原硅酸介导的成骨过程,并在其中发挥了正向调节作用。
【图文】：

流式细胞仪,表面,油红,结节形成

逦山东大学博士学位论文逦逡逑附图表逡逑■■图１：邋ＡＤＭＳＣｓ的培养及成骨、成脂分化鉴定。（ａ）第６代ＡＤＭＳＣｓ形态呈长梭形，逡逑并近乎旋涡状排列；（ｂ）第６代ＡＤＭＳＣｓ成骨诱导２８ｄ后，茜素红Ｓ钙结节染色逡逑示细胞外基质可见深红色的钙结节形成；（ｃ）第６代ＡＤＭＳＣｓ成脂诱导１４ｄ后，逡逑油红０染色示胞质内脂滴被染成鲜红色。标尺均为５００邋ｕ邋ｍ。逡逑＜？ｊ逦｜邋１００－逡逑

成骨,原硅酸

和ＴＲＡＣＰ）的表达均出现上调，说明ｓＲＡＮＫＬ进入细胞内稳定发挥了其促进破骨逡逑分化的作用；但当原硅酸同ｓＲＡＮＫＬ共同作用ＡＤＭＳＣｓ后，上述破骨分化指标的表逡逑达却出现了下调，说明原硅酸具有抑制ｓＲＡＮＫＬ介导的破骨分化作用（图１１、１２）。逡逑既往相关研宄中，Ｍｌａｄｅｎｏｖｉｃ邋Ｚ，邋ｅｔ邋ａｌ．从ｍ邋ＲＮＡ水平同样发现可溶性的二氧化逡逑硅在体外能够抑制破骨细胞的形成及骨吸收［９３］。而本研宄则是在脂肪间充质干细逡逑胞中通过Ｗｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ技术从蛋白水平证实原桂酸具有抑制其破骨分化的作用。逡逑此外，本研宄过程中还发现原硅酸在作用ＡＤＭＳＣｓ后，ＣＴＳＫ的表达出现下调而逡逑Ｃ０Ｌ１的表达却出现上调（图４、８、１１），因ＣＴＳＫ具有降解Ｃ０Ｌ１的作用，，这表明逡逑原硅酸使ＣＴＳＫ表达下调或许是⑶Ｌ１表达上调的原因之一。逡逑总之，本研宄结果表明：原硅酸影响ＡＤＭＳＣｓ骨分化的机制，从促进成骨分逡逑化和抑制破骨分化两方面进行。首先，原硅酸通过激活ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴ０Ｒ信号通路逡逑对ＡＤＭＳＣｓ成骨分化进行正向调节；其次，原硅酸通过下调ＲＡＮＫＬ的表达和上调逡逑０ＰＧ的表达，并同时抑制ＲＡＮＫＬ的作用，抑制ＡＤＭＳＣｓ向破骨分化。此研宄结果逡逑将为探索原硅酸联合脂肪间充质干细胞治疗骨质疏松症提供体外研究的理论依逡逑据
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R580

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