hAMSCs-CM对百草枯所致A549细胞损伤的保护效应及机制探究

发布时间：2020-06-16 05:44

【摘要】：目的:探索人羊膜间充质干细胞培养上清液(hAMSCs-CM)对百草枯所致A549细胞损伤的作用效果及其初步机制。方法:常规培养A549细胞,并加入不同浓度的百草枯(PQ),采用CCK-8试剂检测细胞增殖活力。采用机械-胰蛋白酶联合的方法获取人羊膜间充质干细胞(hAMSCs),常规培养并提取其培养上清液;加入不同浓度的hAMSCs-CM干预PQ染毒后的细胞,分为PBS组、PQ组(造模组)、PQ+hAMSCs-CM组(hAMSCs-CM干预组,根据体积分数分为25%、50%、75%浓度)、hAMSCs-CM组(hAMSCs-CM,对应各浓度),采用CCK-8试剂检测其细胞增殖活力。利用倒置相差显微镜及透射电镜观察PBS组、PQ组、PQ+hAMSCs-CM组(50%浓度)、hAMSCs-CM组(50%浓度)的细胞形态及结构。利用荧光显微镜观察各组细胞活性氧(ROS)的分布情况。采用ELISA法检测各组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、IL-10的含量。采用流式细胞术(FCM)检测上述各组细胞凋亡情况。采用Western blot检测各组Bax、Bcl-2、CHOP及GRP78蛋白的表达情况。结果:1、250μM、500μM、750μM、1000μM终浓度的PQ染毒24h后,其细胞增殖活力下降,得出IC50的PQ浓度为816μM,后期选用750μM作为A549细胞造模浓度。2、PBS组、PQ组、PQ+hAMSCs-CM组(50%浓度)、hAMSCs-CM组(50%浓度)的细胞增殖活力分别为(99.98±4.56)%、(52.52±3.02)%、(63.18±3.97)%、(97.42±2.28)%(F=271.954,P0.01)。3、PQ染毒后,A549细胞形态发生改变,死亡细胞及细胞碎片增多;PQ+hAMSCs-CM组上述改变较PQ组减轻。4、PQ组细胞表面微绒毛、突起减少,内质网肿胀,核染色质团聚分布异常;PQ+hAMSCs-CM组细胞表面可见微绒毛,胞质均匀,细胞器损伤减轻,核染色质均匀。5、PQ组细胞内ROS较PBS组增多,PQ+hAMSCs-CM组较PQ组减少。6、PQ+hAMSCs-CM组上清中IL-10的含量较PQ组高,PQ+hAMSCs-CM组IL-1β、IL-6的含量较PQ组低(均P0.01)。7、PBS组、PQ组、PQ+hAMSCs-CM组、hAMSCs-CM组的细胞早期凋亡率分别为(1.96±0.50)%、(14.16±1.15)%、(7.52±2.35)%、(1.71±0.88)%(F=44.619,P0.01)。8、PQ+hAMSCs-CM组Bax/Bcl-2比例较PQ组低(P0.05),前者CHOP的表达量较PQ组低(P0.01),两组GRP78的表达量无差异(P0.05)。结论:1、hAMSCs-CM能减少活性氧的产生,减少PQ所致A549细胞的炎症因子分泌,减轻内质网等细胞器的损伤。2、hAMSCs-CM可能通过减轻氧化应激及内质网应激途径减轻PQ所致A549细胞的损伤。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R595
【图文】：

科大学硕士学位论文 验结果CCK-8 法检测 PQ 染毒后的细胞增殖活力次实验通过CCK-8 法检测细胞增殖活力，A549 细胞经 250μM、500μM 浓度的 PQ 染毒 24h 后，其生长受到不同程度的抑制，细胞增殖活＜0.01，表 4、图 5）。计算 IC50 的 PQ 浓度为 816μM；在后期实验 浓度的 PQ 作为造模浓度。表 4 CCK-8 检测不同浓度 PQ 染毒后的细胞增殖活力（ x ± s, n=6） 浓度 0μM 250μM 500μM 750μM 增殖活力 100.00 80.10 71.43 51.43 %）±5.48 ±2.78 ±1.27 ±4.45 ：上述检测均在PQ 染毒 24h 后进行。结果比较：F =219.270，P＜0.01。

图 6 倒置相差显微镜观察第 3 代 hAMSCs 细胞（放大倍数：100X）CK-8 法检测hAMSCs-CM 干预后的细胞增殖活力取终浓度为 750μM 的 PQ 染毒 10min 后，加入不同浓度 hAMSCs-Ch 后检测细胞活力，PQ+hAMSCs-CM 组细胞增殖活力均高于 PQ 组，MSCs-CM 干预剂量时细胞增殖活力最高（P＜0.01，表 5、图7）；hAMS 组相比比较无差异。50%浓度 PQ+hAMSCs-CM 组的细胞增殖活力最期研究中，选择 50%浓度的 hAMSCs-CM 作为干预措施。表 5 CCK-8 检测不同浓度 hAMSCs-CM 干预后的细胞增殖活力（ x ± s, n PBS 组PQ 组(750μM)25%浓度 50%浓度 75%浓度 25%浓度 50%浓度 PQ+hAMSCs-CM 组 hAMSCs-CM 组力99.98 52.52 58.70 63.18 59.22 97.55 97.42 ±4.56 ±3.02 ±2.25*±3.97*±1.35 ±6.64 ±2.28 - - 0.003△0.000△0.002△0.477＃0.246＃

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本文编号：2715621