沉默COUP-TFI促进小鼠骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化及机制研究

发布时间：2020-06-18 19:36

【摘要】：目的:糖尿病(DM)主要分为两种类型:I型糖尿病(T1DM)和II型糖尿病(T2DM)。I型糖尿病是一种自身免疫疾病,其病因是由于胰腺β细胞损伤。II型糖尿病表现为胰岛素抵抗导致的血液中胰岛素相对缺乏。近年来有研究表明,II型糖尿病也存在胰岛β细胞凋亡增加导致的β细胞数量降低。因此,无论是T1DM还是T2DM,胰岛β细胞功能失调或缺失都是重要的致病因素,对这些细胞的替换或补充已成为糖尿病研究的主要目标。虽然诸如胰岛移植等治疗手段已经应用于临床,但是由于供体来源有限,这些方法的应用受到很大的制约。近年来干细胞疗法作为一种新兴的技术广泛应用于细胞替代治疗。有文献报道,骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell,bmMSC)在体外能够诱导成胰岛素分泌细胞,但是其分化机制的调控还不是很清楚。转录激活因子NeuroD/BETA2、MafA、Ngn3、Pdx1等能够特异性结合到胰岛素启动子300 400 bp范围内,协同调控胰岛素基因的转录。有研究表明,骨髓间充质干细胞能够通过过表达这些转录激活因子分化为胰岛素分泌细胞。但是,这些分化细胞的胰岛素分泌水平并不充足。MafA是转录因子大Maf家族的一个成员,作为一个重要的Insulin 2基因特异性激活因子调控胰岛素基因的表达。但是有研究表明如果不联合NeuroD/BETA2、Ngn3或者Pdx1等激活因子,单一过表达MafA并不能促进骨髓间充质干细胞分化成为胰岛素分泌细胞。因此我们推测在骨髓间充质干细胞中存在着抑制MafA诱导作用的细胞因子。在低等动物很容易启动再生的过程,随着生物的进化这一过程被抑制,越来越难以启动,寻找这些抑制因素必将促进再生的过程,但是目前对于转录抑制因子了解甚少。在非胰岛素分泌细胞中,如骨髓间充质干细胞中,其所以没有向胰岛β细胞分化,也一定存在某种转录抑制因子,而其可能与抑制胰岛素基因的表达,并且抑制再生有关。因此,发现和研究这些转录抑制因子将有助于促进干细胞更好的分化为胰岛素分泌细胞,从而推进糖尿病的干细胞治疗应用。本研究通过对小鼠bmMSC和胰岛β细胞系Min6中与胰岛素2(Insulin 2,Ins2)基因启动子区结合的核蛋白进行比较研究,发现bmMSC中新的特异结合蛋白COUP-TFI。COUP-TFs属于类固醇/甲状腺素受体超家族,其中有两个主要的因子COUP-TFI和COUP-TFII。COUP-TFI在神经系统,视觉发育和心脏发育中都发挥了重要的作用。它作为重要的调控因子影响少突胶质细胞,视神经前体细胞以及毛发细胞的分化。COUP-TFI能够直接结合到DR1序列抑制基因的表达。小鼠的Ins2基因启动子区域是否存在DR1序列,以及COUP-TFI是否做为转录抑制因子,抑制骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化,未见报道。这可能存在一个胰岛β细胞分化的新机制,可能发现诱导骨髓间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的新方法。因此,我们通过抑制bmMSC细胞中COUP-TFI的表达,同时过表达MafA,促进bmMSC向胰岛素分泌细胞分化,研究其调控胰岛β细胞分化的方式及分子机制。研究应用骨髓间充质干细胞分化为胰岛β细胞对糖尿病治疗的新策略。方法:一、bmMSC中Ins2基因新的结合蛋白COUP-TFI的研究1、bmMSC和Min6细胞培养及生物学特征鉴定。2、通过DNA亲和沉淀发现新的与胰岛素启动子区结合蛋白。3、通过RT-PCR和Western Blot检测COUP-TFI在Min6和bmMSC细胞中的表达。4、通过免疫荧光检测COUP-TFI在胰腺组织中的分布。二、沉默bmMSC中COUP-TFI的表达促进bmMSC向胰岛素分泌细胞分化的研究1、通过实时荧光定量PCR技术检测COUP-TFI对Min6细胞中Ins2表达的作用。2、通过双荧光素酶报告基因检测COUP-TFI对Ins2启动子活性的作用。3、通过实时荧光定量PCR技术检测siCOUP-TFI对bmMSC细胞中Ins2表达的作用。4、通过双荧光素酶报告基因检测MafA与siCOUP-TFI对Ins2启动子活性的作用。5、分化细胞的双硫腙染色和葡萄糖刺激实验。6、动物实验检测分化细胞的功能。三、转录抑制因子COUP-TFI调控Ins2的分子机制研究1、通过生物信息学方法寻找小鼠Ins2基因启动子区与COUP-TFI结合的位点。2、通过ChIP和EMSA检测COUP-TFI的结合情况。3、通过Co-IP和Ch IP检测COUP-TFI是否与NCoR、SMRT及HDAC3形成转录抑制复合物。结果:一、发现小鼠bmMSC和Min6细胞中Ins2基因启动子区差异结合蛋白COUP-TFI。1、流式细胞术分析显示bmMSC细胞Sca-1,CD44和CD29表达阳性;CD117,CD31和CD45表达阴性,符合骨髓间充质干细胞的特性。2、bmMSC可以诱导分化成软骨、骨和脂肪细胞。具有多潜能性。3、COUP-TFI是Ins2基因启动子新的结合蛋白。4、COUP-TFI在bmMSC细胞中表达,但在Min6细胞中不表达。5、COUP-TFI广泛分布在脑组织中,但是在胰腺组织中未发现阳性染色二、通过沉默bmMSC中COUP-TFI的表达,同时过表达MafA,能促进bmMSC向胰岛素分泌细胞分化。1、COUP-TFI能降低Ins2启动子区活性。2、干扰COUP-TFI的同时过表达MafA能显著增强Ins2启动子区活性。3、干扰COUP-TFI的同时过表达MafA使bmMSC表达胰岛内分泌细胞特异性标志物,如Ins1,Ins2,Pdx1,Isl-1,Glut2和Pax6,向胰岛素分泌细胞分化。4、分化的细胞能够响应葡萄糖刺激释放C肽和胰岛素,双硫腙染色阳性。5、移植分化的细胞能降低糖尿病小鼠血糖水平。三、COUP-TFI通过与NCoR,SMRT和HDAC3形成复合物结合到Insulin 2启动子区DR-1序列,抑制Insulin 2的表达1、小鼠Ins2基因启动子区-53 bp至-40 bp处存在DR1位点。2、ChIP和EMSA发现COUP-TFI能够特异结合在DR1位点。3、ChIP检测发现NCoR、SMRT及HDAC3同样在该区域富集4、Co-IP结果显示COUP-TFI能够与NCoR、SMRT及HDAC3形成转录共抑制复合物。结论:COUP-TFI是小鼠Ins2基因启动子区结合蛋白。其在小鼠bmMSC中表达,在Min6和胰腺组织内胰岛β细胞中不表达,可能是Ins2的抑制因子。抑制COUP-TFI协同过表达MafA有利于使bmMSC在体外向胰岛素分泌细胞分化。并能显著降低糖尿病模型小鼠的血糖。COUP-TFI并且通过与NcoR、SMRT和HDAC3形成复合物特异结合到DR1位点,抑制Ins2基因的表达。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.1
【图文】：

图 1.1 bmMSC 和 Min6 细胞形态A：光镜下培养至第三代的小鼠 bmMSC 呈单层贴壁生长，形态均一，边界清晰，呈贴壁生长；B：光镜下小鼠 Min6 细胞贴壁生长，成克隆样集落。比例尺表示 100μm。3.2 bmMSC 的生物学特征鉴定为了检测 bmMSC 的纯度，我们对第三代的细胞进行流式细胞术分析，结果示细胞 Sca-1，CD44 和 CD29 表达阳性，CD117，CD31 和 CD45 表达阴性，符间充质干细胞特征（图 1.2）。为了检测 bmMSC 的分化潜能，我们将 bmMSC 分在成软骨、成骨和成脂诱导分化培养液中培养，结果显示 bmMSC 可以分化成软（阿尔辛蓝染成蓝色，图 1.3A），骨（茜素红染成红色，图 1.3 B）和脂肪细胞（红染成红色的脂滴，图 1.3 C）。不加诱导分化培养基的 bmMSC，培养相同时间为对照，染色均为阴性（图 1.3 D，E，F）。以上结果显示，我们培养的 bmMS备间充质干细胞的特征，并且具有分化潜能。

图 1.2 bmMSC 流式细胞分析流式细胞仪分析第三代 bmMSC 表面标志物 Sca-1，CD44，CD29，CD117，CD31 和 CD45的表达。

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 Florian B?hrnsen;Henning Schliephake;;Supportive angiogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stromal cells and endothelial cells in monolayer and co-cultures[J];International Journal of Oral Science;2016年04期

2 Shalini Singh;Kauser Usman;Monisha Banerjee;;Pharmacogenetic studies update in type 2 diabetes mellitus[J];World Journal of Diabetes;2016年15期

本文编号：2719734