系统性红斑狼疮环状RNA表达谱研究及潜在分子标志物的筛选与鉴定

发布时间：2020-06-26 07:15

【摘要】：目的:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种常见的慢性系统性自身免疫性疾病,女性发病明显多于男性,约为9:1。其病程迁延反复,临床表现复杂多样,可引起多组织、器官的损伤。其致病机制至今尚未明确,普遍认为与遗传、环境、激素、免疫等多种因素有关。虽然糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂的合理应用可明显缓解SLE患者的病情和预后判断,但该病的治疗现状仍不尽如人意,在治疗过程中还要面临复发等严峻问题。目前,SLE的实验室诊断主要依赖于抗核抗体、抗双链DNA、抗Sm等自身抗体,但这些自身抗体存在敏感性或特异性差的缺陷,大大限制其临床价值。因此,迫切需要建立新技术和发现新的标志物来解决这些问题。环状RNA(Circular RNA,circRNA)是区别于传统线性RNA的一类新型RNA分子,具有闭合环状结构,大量存在于真核转录组中。诸多研究发现circRNA参与了疾病的发生发展,包括自身免疫性疾病。因此,寻找SLE患者中异常表达的circRNA,探讨circRNA与SLE发病及其病程的关联,有助于阐明SLE的发病机制,为SLE的诊断和靶向治疗提供理论依据。方法:1.本项目采用病例对照研究,收集30对SLE患者和正常健康对照的血浆标本,6对用于基因芯片技术筛选其血浆中差异表达的circRNAs。24对用于qRT-PCR技术初步验证显著差异表达的circRNAs。2.应用 TargetScan、miRbase、miRanda、GO和 KEGG 等数据库对显著差异表达的circRNAs进行深度生物信息学分析,进行靶基因预测及信号通路分析。3.应用 qRT-PCR 技术扩大样本量验证 hsa_circ_400011 和 hsa_circ_100226在43例SLE患者、40例正常对照和36例疾病对照血浆中的表达情况,分析其表达水平与实验室指标的相关性并评价其诊断效能。4.分离SLE患者和正常健康对照者外周血中的PBMC,检测hsa_circ_400011和hsa_circ_100226在PBMC中的表达水平及评价其诊断效能。同时检测经生物信息学预测分析的hsa_circ_400011和hsa_circ_100226对应的miRNAs在PBMC中的表达情况。结果:1.circRNA芯片的筛查结果发现,在SLE患者血浆中共筛选出207个差异表达的circRNAs,其中113个基因表达上调,94个基因表达下调。挑选了差异倍数大且P值小的5个表达上调和3个表达下调的circRNAs分子进行初步验证,结果显示,hsa_circ_101471、hsa_circ_102584 和 hsa_circ_400011 表达上调与芯片结果一致,hsa_circ_100226表达下调与芯片结果一致。2.对差异表达显著的circRNAs进行了深入生物信息学分析,预测了其靶基因,通过GO分析和KEGG Pathway分析,构建了 circRNA-miRNA-mRNA网络互作图。发现hsa_circRNA_100226可能在与SLE疾病相关的renal cell carcinoma通路中发挥重要作用。hsa_circRNA_100226可能通过抑制miRNA水平影响靶基因Ets-1表达,进而影响SLE疾病的发生发展。3.扩大样本量验证hsa_circ_400011和hsa_circ_100226在血浆中的表达情况,结果表明,与正常对照和疾病对照相比,hsa_circ_400011在SLE患者血浆中的表达显著升高(SLEvs Normal control:P=0.016;SLEvs Disease control:P=0.014),hsa_circ_100226在SLE患者血浆中的表达显著降低(SLE vs Normal control:P=0.007;SLE vs Disease control:P=0.043),均有统计学意义。诊断效能评价显示hsa_circ_400011和hsa_circ_100226的ROC曲线下面积均位于0.5-0.7之间,疾病识别能力较低。而二者分别与ANA联合诊断的AUC为0.925和0.931,三者联合诊断的AUC为0.921,均高于使用单一指标诊断时的AUC,可提高诊断效能,提示hsa_circ_400011和hsa_circ_100226对SLE的诊断可能具有一定价值。其表达水平与SLE患者实验室检测指标的相关性分析表明,血肌酐升高组与非血肌酐升高组间的hsa_circ_1 00226表达水平差异有统计学意义(Z 血肌酐升高=-2.307,P血肌酐升高=0.021),未发现 hsa_circ_400011 和 hsa_circ_100226与其他疾病相关检测指标之间的相关性。稳定期和活动期的SLE患者之间,hsa_circ_400011和hsa_circ_100226的表达均无显著统计学差异。4.经 qRT-PCR 检测 PBMC 中 hsa_circ_400011 和 hsa_circ_100226 的表达结果显示,与正常对照相比,SLE患者PBMC中hsa_circ_400011的表达明显升高,hsa_circ_100226的表达显著降低,差异具有统计学意义(P分别为0.026和0.000)。hsa_circ_400011 的 ROC 曲线下面积为 0.624,诊断效率较低;hsa_circ_100226的ROC曲线下面积为0.738,有较好的诊断效能;二者联合诊断的AUC为0.769,略高于单一诊断,可提高诊断效能。此外,miRNAs在PBMC中的表达情况显示,与正常对照相比,hsa_circ_400011对应的miRNAs分子:hsa-miR-296-3p,hsa-miR-146b-3p和hsa-miR-181d-3p的表达均明显升高,且具有统计学意义,但与生物信息学预测分析不相符,说明hsa_circ_400011与这些miRNAs可能不存在竞争吸附关系;hsa_circ_100226对应的miRNAs分子:hsa-miR-138-5p,hsa-miR-145-3p和hsa-miR-875-3p的表达显著升高,且具有统计学意义,与预测分析相符。推测hsa-_circ_100226/hsa-miR-875-3p/Ets-1途径可能在SLE的致病过程中发挥重要作用。结论:研究结果表明SLE患者血浆和PBMC中存在差异表达的circRNAs。hsaI_circ_400011表达水平显著升高,hsa_circ_100226表达水平显著降低,二者具有作为SLE分子标志物的潜能并可能与SLE发病机制相关。hsa_circ_100226可能参与SLE疾病相关的renal cell carcinoma信号通路,通过竞争吸附miR-875-3p影响靶基因Ets-1的表达,进而影响SLE疾病的发生发展。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R593.241
【图文】：

图１－１．研宄第一章的主要技术路线图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏａｄｍａｐ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｔｕｄｙ邋１逡逑１５逡逑

完整的Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ应具有明显的２８ｓ邋ｒＲＮＡ和１８ｓ邋ｒＲＮＡ两个电泳条带，并且２８ｓ逡逑ｒＲＮＡ条带的亮度较高，约是１８ｓ邋ｒＲＮＡ亮度的两倍。本实验中１２例样本Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ逡逑的完整性检测结果可见图１－２所示。逡逑表１－４．邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋ＮＤ－１０００检测总ＲＮＡ质量结果逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－４．邋ＲＮＡ邋Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋Ｑｕａｌｉｔｙ邋Ａｓｓｕｒａｎｃｅ邋ｂｙ邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋ＮＤ－１０００逡逑Ｓａｍｐｌｅ邋ＯＤ２６０／２８０邋ＯＤ２６０／２３０逦ＱＣ邋ｒｅｓｕｌｔ逡逑Ｃｏｎｃ．（ｎｇ／｜ｊＪ）邋Ｖｏｌｕｍｅ（ｊｘｌ）邋Ｑｕａｎｔｉｔｙ（ｎｇ）逡逑ＩＤ邋Ｒａｔｉｏ逦Ｒａｔｉｏ逦Ｐａｓｓ邋ｏｒ邋Ｆａｉｌ逡逑Ｃｌ逦１．７７逦０．９６逦２４５．８２逦１０逦２４５８．２０逦Ｐａｓｓ逡逑Ｃ２逦１．６６逦０．７５逦２１３．０１逦１０逦２１３０．１０逦Ｐａｓｓ逡逑Ｃ３逦１．６２逦０．６３逦２１７．１３逦１０逦２１７１．３０逦Ｐａｓｓ逡逑Ｃ４逦１．４５逦０．４８逦２０８．２７逦１０逦２０８２．７０逦Ｐａｓｓ逡逑Ｃ５逦１．６７逦０．５１逦１

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 崔静;朱铁楠;赵永强;张奉春;;系统性红斑狼疮合并血栓性血小板减少性紫癜14例临床分析[J];中华内科杂志;2013年05期

本文编号：2730002