CYR61介导DDR2过分泌MMP1的分子机制及其在RA滑膜细胞侵袭中的作用研究

发布时间：2020-07-04 08:57

【摘要】：类风湿性关节炎(RA)是一种以关节致残性病变为主的自身免疫性疾病。与其他类型关节炎的区别在于,RA受累关节的主要病理表现为炎性细胞浸润、持续性滑膜炎、血管翳形成、滑膜组织异常增生以及软骨和骨的进行性破坏等。RA发病早期T细胞依赖性自身免疫导致关节腔内发生炎性渗出,进入慢性期后非T细胞依赖性滑膜过度增生、侵袭破坏关节软骨和软骨下骨是RA晚期关节软骨破坏的重要原因。因此,深入研究RA关节软骨破坏相关的信号转导过程,探寻其中的重要环节和关键信号转导分子,对于更好地防治RA有着极其重要的意义。我们前期的实验研究发现,在RA滑膜成纤维样细胞中存在一种特殊的、具有受体酪氨酸蛋白激酶活性的盘状结构域受体DDR2且呈高表达状态;它以胶原为配体,通过同源二聚化使其胞内区第471位酪氨酸残基发生磷酸化修饰,处于持续活化状态,促进MMP1和MMP13的大量分泌,参与RA关节软骨破坏;体外表达纯化的DDR2受体胞外区蛋白可与DDR2竞争性结合II型胶原,抑制RA FLS分泌MMP1,在CIA大鼠模型中观察到可溶性的DDR2可改善关节软骨的破坏。因此,我们提出在RA滑膜组织增生侵袭破坏软骨的进程中可能存在这样一个恶性循环:在异常的自身免疫状态下,软骨脱落的II型胶原激活滑膜成纤维样细胞中的DDR2受体,从而诱导滑膜成纤维样细胞过表达MMPs;DDR2受体在胶原强大而持续的作用下持续活化,使得滑膜成纤维样细胞不断地分泌MMPs,这些持续分泌的MMPs对骨和软骨产生严重的破坏;然而,被破坏的软骨又可进一步释放大量的胶原物质,随即成为MMPs的诱导因素,如此反复,周而复始。然而从膜受体DDR2活化到胞内效应分子MMPs的过度分泌,其中详细的作用机制及关键信号转导分子尚不清楚。CYR61是我们利用Agilent Human 1A基因表达谱芯片对II型胶原刺激前后RA滑膜成纤维样细胞进行差异分析获得的基因,为了深入探讨CYR61在DDR2-MMPs通路中扮演的角色及其对RA关节软骨破坏的作用,我们进行以下实验研究:首先,我们利用Real-time PCR、Western-blot以及免疫组化等实验技术系统分析DDR2、CYR61以及MMPs在RA滑膜组织中的表达水平和表达分布,评价CYR61在RA发生、发展的临床意义;其次,应用Real-time PCR和蛋白免疫印迹观察上调或者下调DDR2的活化水平对CYR61表达水平的影响并通过EMSA、双荧光素酶报告基因、Real-time PCR和蛋白免疫印迹等方法阐明DDR2调控CYR61表达的分子机制,从而揭示II型胶原-DDR2-CYR61通路的存在;接着,以过表达腺病毒Ad-CYR61和CYR61 si RNA为研究工具,采用Real-time PCR和蛋白免疫印迹方法验证CYR61对下游效应分子MMPs的影响,同时,综合运用生物信息学、双荧光素酶报告系统、染色质免疫共沉淀以及凝胶迁移实验等实验方法,深入探讨CYR61调控MMPs表达的具体分子机制;然后,使用Transwell和细胞划痕实验检测关键分子CYR61对RA滑膜成纤维样细胞侵袭迁移功能的影响;最后,通过构建Wistar大鼠CIA模型,给予干涉腺病毒sh CYR61局部治疗,阻断动物关节局部CYR61的表达,来评估腺病毒sh CYR61对CIA大鼠关节软骨损伤的治疗效果。通过以上实验研究我们获得了下列结果:①Real-time PCR结果显示,RA患者滑膜组织中DDR2、CYR61以及MMP1、MMP9、MMP13的m RNA表达水平均高于OA患者滑膜组织,DDR2与CYR61 m RNA的表达水平呈正相关,CYR61与MMP1m RNA的表达水平呈正相关。②蛋白免疫印迹结果同样显示,RA患者滑膜组织中DDR2、CYR61及MMP1的蛋白表达水平均显著高于OA患者滑膜组织。免疫组化结果显示,DDR2、MMP1均表达于滑膜衬里层,DDR2与MMP1在RA滑膜组织中的表达水平高于OA;CYR61则泛表达于多种组织中,RA滑膜及滑膜下结缔组织中CYR61的表达水平高于OA。③利用Real-time PCR和蛋白免疫印迹观察上调或者下调DDR2的活化水平对CYR61表达水平的影响,结果显示II型胶原刺激DDR2活化能够促进CYR61的表达,干涉DDR2抑制CYR61的m RNA和蛋白表达水平。④EMSA和双荧光素酶报告基因结果显示II型胶原诱导DDR2活化可增强转录因子AP-1在CYR61启动子区域的结合活性,从而诱导CYR61转录活性升高,促进CYR61的表达。⑤CYR61能够调控转录因子ETS1转录水平和蛋白水平的表达。⑥双荧光素酶报告基因、Ch IP和EMSA实验结果显示,转录因子ETS1通过与MMP1基因转录起始位点上游-122~-102 bp启动子序列直接结合,增强MMP1的转录活性,促进MMP1的表达。⑦Transwell和细胞划痕实验结果表明,CYR61能够促进FLS细胞侵袭迁移功能。⑧动物实验结果显示,干涉CYR61的表达能够明显降低关节炎的发生率和关节炎指数评分,显著改善关节软组织肿胀程度;⑨X射线和Micro-CT检查结果提示,干涉腺病毒sh CYR61对CIA大鼠关节软骨破坏具有良好的治疗效果;⑩组织病理学检查结果发现阻断CYR61的表达能够减少炎性细胞的浸润。本研究中我们首次证实了CYR61作为DDR2-MMPs通路中的关键信号转导分子在介导DDR2过分泌MMPs及促进RA FLS细胞侵袭迁移和关节软骨损伤过程中发挥重要作用。该研究结果完善和补充了DDR2-MMPs通路中关键环节和关键信号转导分子,为进一步阐明RA中晚期病变的发病机制及新的药物靶点的开发提供了新思路。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.22
【图文】：

图 0-1 类风湿关节炎血管翳中的免疫及病理机制示意图引自：AbelesAM. Bull NYU Hosp Jt Dis. 2006; 64: 20-24.

图 0-2 DDRs 结构示意图引自：Brigit. Int Rev Cell Mol Biol. 2014; 310: 39-87.特点泛表达于胚胎发育阶段和成人个体的不同组织，如骨骼、统和免疫系统。目前，尚没有文献系统的分析不同组织中 不同类型细胞中，DDR2 的表达受不同转录因子的调控，下，大鼠心脏平滑肌细胞中 DDR2 启动子区 Myc-Max DNR2 表达水平升高[18]；在成骨细胞分化过程中，转录因子 ACAAT 增强子结合位点结合，促进 DDR2 转录；肝损伤可mRNA 表达水平上调[19]。Sekiya 等[20]发现 microRNA-29 b 达，由于 microRNA-29 b 下游靶基因是 I 型胶原，故 I 型

本文编号：2740916