对铅中毒小鼠具有保护作用的益生菌的分离、鉴定及功能研究

发布时间：2020-07-07 14:34

【摘要】：一、研究背景和研究目的铅是一种广泛存在于生活环境和职业环境的有毒重金属,长期暴露于高铅环境,将严重损伤神经、造血、消化道和生殖等多个系统,对儿童神经系统的影响尤为显著。目前,对于铅中毒的治疗多采用金属螯和剂,如依地酸二钠钙(CaNa2EDTA)、2,3-二巯基丁二酸(DMSA),研究证明,金属螯和剂会产生持续的胃肠道不良反应、“过络合综合征”、肝肾毒性等毒副作用,不适用于孕妇、哺乳期妇女及儿童。因此,需要寻找新的方法或制剂防治这类人群的铅中毒。国内外研究证明多种益生菌可吸附体内、外的重金属,但仍少有涉及分离吸附铅的益生菌的研究。本研究拟从健康新生儿粪便中分离益生性能佳、铅吸附力强的乳酸菌,并构建铅暴露母鼠致子代鼠铅中毒模型,探究该乳酸菌对铅暴露母鼠及铅中毒子代鼠的保护作用。二、研究方法1.利用成年无特定病原体(SPF)级C57BL/6小鼠构建母鼠孕期及哺乳期暴露铅致子代鼠铅中毒模型,母鼠经饮用浓度为200mg/L的铅水,直至子代鼠21日龄时处死母鼠及子代鼠,称量子代鼠体重及肝、肾、脑等器官的重量,取血、骨、脑、肾、肝脏及小肠,进行铅浓度检测;肝脏进行GSH、GSH-Px、SOD及NO等氧化应激因子检测;对大脑及小肠作HE染色,评价其病理损伤情况。选择鼠李糖乳杆菌GG株(Lactobacillus rhamnosus GG,LGG)对铅暴露母鼠进行干预,探讨益生菌LGG对铅中毒子代鼠发挥保护作用。2.收集健康新生儿粪便为来源,利用中央扩散法分离并筛选具有铅吸附力的乳酸菌,并测定分离菌的生理生化特性、益生黏附特性、抑制致病菌特性及体外铅吸附能力等性能。3.利用1成功构建的母鼠铅暴露致子代鼠铅中毒模型,降低母鼠饮用铅水的浓度为1OOmg/L,并使用筛选所得的乳酸菌进行干预,称量母鼠及子代鼠体重及肝、肾、脑等器官的重量,取血、骨、脑、肾、肝脏及小肠,进行铅浓度检测;对子代鼠肝脏及肾脏中NO等氧化应激因子检测;粪便进行16SrRNA测序;并对大脑及小肠作HE染色,评价其病理损伤情况。探究分离所得的具有铅吸附力的乳酸菌对铅暴露母鼠及铅中毒子代鼠的保护作用。三、研究结果1.母鼠经饮用200mg/L的醋酸铅水暴露铅,导致子代鼠体重和肝脑的脏器指数降低而肾的脏器指数升高(P0.05),血、骨、脑和肾组织的铅含量升高(p0.05),肝脏中GSH、GSH-Px、SOD等活性降低、NO活性升高(p0.05),脑及小肠出现病理损伤,成功建立母鼠铅暴露致子代鼠铅中毒模型。2.使用LGG干预母鼠后可使子代鼠体重和肝脑的脏器指数升高、肾的脏器指数降低(p0.05),并减少铅在子代鼠血液、脑、肾和骨骼等组织的蓄积量(p0.05),肝脏GSH、GSH-Px、SOD等抗氧化应激因子活性升高(p0.05),而氧化应激因子NO活性降低(p0.05),且子代鼠脑及小肠的病理损伤得到改善。3.从健康新生儿粪便中分离获得一株干酪乳杆菌,命名为SYF-08,保藏于广东省微生物菌种保藏中心,编号为GDMCC 60441。该菌生长稳定、益生性能良好、可稳定地黏附于肠道上皮细胞,铅吸附力强,在250ppm的铅溶液中,SYF-08的铅吸附率高达到51.00±6.81%,在浓度为2500mg/L的MRS平板上仍能生长。4.降低母鼠饮用的醋酸铅水浓度为1OOmg/L,仍可致子代鼠铅中毒。使用SYF-08干预铅暴露母鼠后,子代鼠体重和肝脑的脏器指数升高而肾的脏器指数降低(p0.05),铅在母鼠血液、骨骼、肾脏和子代鼠血液、脑、肾脏等重要组织器官的蓄积降低(p0.05),母鼠及子代鼠的肠道及脑组织的病理损伤得到有效缓解,子代鼠肝脏及肾脏中NO的活性也显著降低(p0.05),同时子代鼠肠道菌群的多样性及菌群组成得到恢复。四、结论本实验成功构建母鼠铅暴露致子代鼠铅中毒的动物模型,并从健康新生儿粪便分离获得一株具有自主知识产权的吸附铅能力强的干酪乳杆菌SYF-08,该菌对铅暴露母鼠及铅中毒子代鼠均具有保护作用,可作为防治铅中毒的功能性食品或药品进行下一步开发。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R595.2
【图文】：

抗氧化酶,氧化应激损伤,氧化应激,相关因子

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋ｏｘｉｄａｔｉｖｅ邋ｓｔｒｅｓｓ邋ｒｅｌａｔｅｄ邋ｆａｃｔｏｒｓ邋ｉｎ邋ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ’ｓ邋ｌｉｖｅｒ逡逑４．肠组织病理结果逡逑对子代鼠小肠进行ＨＥ染色，结果显示（图１－４），Ｐｂ组子代鼠小肠病理损逡逑伤严重，肠上皮细胞的标志性空泡消失、排列疏松，胞核移动至胞质中间，无逡逑极性；杯状细胞体积变小、数量减少；小肠腺萎缩；中央乳糜管变窄甚至消失。逡逑干预组ＬＧＧ．Ｐｂ小肠的病理损伤减轻，肠上皮细胞排列紧密，胞核极性正常；杯逡逑状细胞及中央乳糜管形态恢复正常。提示ＬＧＧ干预后

中央乳糜管,小肠腺,小肠,上皮细胞

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ’ｓ邋ｓｍａｌｌ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（２０0ｘ）逡逑５．脑组织病理结果逡逑对子代鼠脑组织进行ＨＥ染色，结果显示（图１－５），Ｐｂ组子代鼠大脑皮层逡逑有明显的病理损伤：出现弥漫性神经元固缩、星形胶质细胞增生水肿等病理损逡逑伤，并有不同程度的神经元坏死现象。干预组ＬＧＧ．Ｐｂ的病理损伤有所恢复，大逡逑脑皮层细胞排列紧密，小胶质细胞和星形胶质细胞增生、水肿情况明显减少，逡逑少有神经元细胞坏死。说明，ＬＧＧ干预母鼠铅暴露可缓解子代鼠大脑皮层的病逡逑１８逡逑

星形胶质,神经元,箭头,星形胶质细胞

逡逑图１－４各组子代鼠小肠的结构（２００Ｘ）邋Ａ．ＮＣ组Ｂ．Ｐｂ组ＣNＧＧ．Ｐｂ组逡逑ＤNＧＧ组（小箭头示小肠腺萎缩，大箭头示中央乳糜管消失，圆圈部分示小肠逡逑上皮细胞细胞核极性偏移。）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ’ｓ邋ｓｍａｌｌ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ（２０0ｘ）逡逑５．脑组织病理结果逡逑对子代鼠脑组织进行ＨＥ染色，结果显示（图１－５），Ｐｂ组子代鼠大脑皮层逡逑有明显的病理损伤：出现弥漫性神经元固缩、星形胶质细胞增生水肿等病理损逡逑伤，并有不同程度的神经元坏死现象。干预组ＬＧＧ．Ｐｂ的病理损伤有所恢复，大逡逑脑皮层细胞排列紧密，小胶质细胞和星形胶质细胞增生、水肿情况明显减少，逡逑少有神经元细胞坏死。说明，ＬＧＧ干预母鼠铅暴露可缓解子代鼠大脑皮层的病逡逑１８逡逑

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