血管抑素对糖尿病大鼠视网膜组织改变的影响及其VEGF的表达

发布时间：2017-03-30 15:13

  本文关键词：血管抑素对糖尿病大鼠视网膜组织改变的影响及其VEGF的表达，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：1.研究目的及意义 糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最为常见的,也是重要的致盲性眼病.15年病程的糖尿病患者大约有10%因视网膜病变而发生严重视力障碍,约2%成为盲目。糖尿病性视网膜病变是糖尿病性微血管病变中最重要的表现,是一种具有特异性改变的眼底病变,血-视网膜屏障(blood, retinalbarrier, BRB)破坏、新生血管形成,后期新生血管收缩牵拉引起视网膜脱离。DR的发病机制十分复杂,至今尚未完全阐明。但任何病理改变在本质上均是体内动态平衡的失调,新生血管的形成亦然,血管刺激因素增强和(或)抑制因素减少使两者平衡失调即所谓的“血管生成开关”形成。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor, VEGF)是体内促进新生血管形成的主要因子之一.近年来在DR的发病机制以及治疗的研究中广受关注。 新近发现的血管抑素,经体内、外实验证明能特异的抑制血管内皮细胞的增殖和迁移,从而抑制新生血管形成,血管抑素的抗肿瘤血管生成研究已有大量报导,众多实验表明：血管内皮生长因子(VEGF)在缺氧相关的视网膜新生血管发生中起着最关键的作用。 因此,阐明糖尿病与视网膜VEGF之间的关系,探讨血管抑素抑制新生血管作用机理,可为预防和治疗糖尿病性视网膜病变寻找有效手段,势必为其临床应用奠定坚实的基础,并产生巨大的社会和经济效益。 2.研究方法和过程 1)实验动物模型制作 选取健康SD大鼠80只,适应性饲养1周并进行自由饮水和进食,实验前所有大鼠称体重,且经检查眼前节均无病理改变,尾静脉采血后经血糖仪检测血糖均在正常值范围以内。然后禁食12h,予以腹腔注射链脉佐菌素,剂量为60mg/kg,建立糖尿病模型,每天检测血糖水平,血糖高于350mg/dl者认为糖尿病大鼠模型诱导成功,造模成功共72只,随机分为两组：A组即造模实验组,B组即造模对照组,每组36只；再取正常SD大鼠36只,予以腹腔注射等体积的柠檬酸盐缓冲溶液,作为C组即正常对照组。 (2)玻璃体腔注射 10g·L-1戊巴比妥钠50mg·kg.1腹腔注射麻醉大鼠,美多丽散瞳,爱尔卡因表面麻醉,实验结束后滴3g·L-1泰利必妥眼液预防感染。27号针头打眼后以微量注射器(上海激光光学仪器厂)血管抑素溶液按7.5μg/5μl由大鼠左眼颞侧角膜缘后1mm玻璃体内注射,并确定无晶状体损伤。A组大鼠均按此法予以左眼玻璃体腔内注射血管抑素溶液；B、C组大鼠左眼球均注射等体积的PBS溶液。造模2周后各组大鼠每天注药一次,连续注药4天。 (3)视网膜组织病理切片制备及观察 连续用药后的第12天、33天、61天分别摘除各组12只大鼠的眼球迅速固定于4%多聚甲醛中,2小时后将眼前节部分去除,玻璃体腔中置入脱脂棉以防止发生视网膜脱离,继续固定24小时,酒精梯度脱水,透明后浸蜡包埋切片,厚度为4μm,将脱蜡至水的切片放入苏木素水溶液中染色10min；氨水中分化数秒；流水冲洗1h后自来水冲洗后伊红染液染色5min,自来水冲洗。脱水透明后封片。 (4)大鼠视网膜VEGF蛋白检测：于第12天、33天、61天分别取各组12只大鼠的视网膜,用抗VEGF抗体进行Western blot印迹分析,取每种组织的等量总蛋白(50μg),经变性、电泳、电转膜、加抗VEGF的多克隆抗体(1：1000)孵育,用间接酶联检测法进行显影。同一样本经洗脱处理后再加上抗p肌动蛋白(β-actin)抗体孵育、显影。将显影后所得到的信号使用光密度分析法进行半定量分析,并使用β-actin标准化。 3.主要结果 (1)糖尿病大鼠模型的建立成功大鼠糖尿病模型的造模前后,观察每周血糖及体重变化。造模后STZ造模组大鼠出现糖尿病的“三多一少’(多饮、多食、多尿及体重下降)症状,体重较正常对照组大鼠的体重明显下降,其血糖值明显高于同期正常对照组(P0.01)。STZ造模组的血糖值在1-4周呈逐渐升高趋势,5-7周处于相对平稳期。 (2)大鼠视网膜组织切片HE染色可见C组视网膜各层细胞排列整齐,细胞形态正常,无明显病理变化。不同时期A、B组可见视网膜组织结构疏松,组织明显水肿,尤其是在静脉血管周围,细胞排列紊乱。不同时期A组染色可见视网膜水肿较B组轻,细胞排列相对整齐。 (3)血管抑素对模型大鼠视网膜VEGF表达的影响B组大鼠视网膜的VEGF水平明显高于A组STZ大鼠左眼的,A、B且都高于正常对照组即C组,随时间的增加呈先下降后上升的趋势；A组视网膜的VEGF水平随时间的增加也呈先下降后上升的趋势,且高于C组(第33天除外)。不同时间段C组视网膜的VEGF水平没有发生变化。 4.主要结论 以前人们普遍认为,糖尿病性视网膜病最早发生的病变是在糖尿病病程中、后期出现的视网膜微血管的病变。然而,近年来研究表明,在糖尿病早期阶段,视网膜就已经发生了病理改变。 本实验选用雄性SD大鼠按60mg/kg体质量腹腔注射STZ,诱发接近人类1型DM的大鼠模型,形成糖尿病视网膜病变的早期病变,造模成功率达90%,可见STZ大鼠模型安全、可靠、方便、可行,成功率高。 本实验通过对视网膜HE染色发现,STZ糖尿病大鼠12天时大鼠视网膜HE染色各层未能观察到明显的变化。糖尿病33天时,视网膜内发生可见的病理变化,组织发生一定程度的水肿。随病程延长至61天时,视网膜各层病理改变逐渐加重,也说明在糖尿病病程最初期,视网膜各层的组织学病变并不明显,且视网膜各层的组织病变是随病程进展而逐渐发生的。此外,注射了PBS的B组大鼠视网膜内外核层分离,内核层细胞排列紊乱,密度降低,神经节细胞数目减少,而注射了的血管抑素的A组明显减少血管内皮细胞的增生,组织水肿情况好转。 综上所述,本次研究通过对视网膜VEGF的差异表达检测,得出注射血管抑素能明显降低STZ糖尿病大鼠视网膜的VEGF表达水平,但是仍稍高于对照组,证实了糖尿病性视网膜中VEGF的高表达,且说明血管抑素在DR的治疗中具有潜在的应用价值。
【关键词】：血管抑素 糖尿病性视网膜病变 新生血管 VEGF
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R587.2;R774.1
【目录】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-31
• 第一部分 材料与方法31-37
• 1. 糖尿病大鼠模型的建立31-32
• 2. 玻璃体腔内注射32-33
• 3. 视网膜组织切片的制备33-35
• 4. 免疫组化检测35-37
• 第二部分 结果37-43
• 1. 模型建立结果37
• 2. 玻璃体腔内注射血管抑素观察结果37-38
• 3. 模型大鼠视网膜组织切片38-40
• 4. 血管抑素对模型大鼠视网膜VEGF表达的影响40-43
• 第三部分 讨论43-48
• 1. 实验性STZ糖尿病动物模型评价43-44
• 2. 视网膜组织病理变化的讨论44-45
• 3. VEFG在糖尿病大鼠视网膜中的表达及血管抑素对其影响讨论45-48
• 第四部分 缺点与不足48-49
• 攻读硕士学位期间成果49-50
• 参考文献50-60
• 致谢60-61

【参考文献】

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1 宋鄂,董宇,韩丽娜,隋东明,徐琪,王心蕊,吴稼祥;Diabetic retinopathy:VEGF, bFGF and retinal vascular pathology[J];Chinese Medical Journal;2004年02期

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本文编号：277425