内源分泌型游离晚期糖化终末产物受体（esRAGE）对AGEs诱导内皮细胞凋亡的保护作用

发布时间：2020-08-05 08:08

【摘要】：目的:既往大量研究已经证实晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)可以引起内皮细胞功能失调和凋亡。AGEs导致内皮细胞损伤主要通过与细胞表面受体RAGE结合,从而激活细胞内一系列信号分子,尤其是通过导致NF-κB的表达上调引起后续炎症反应损伤。内源分泌型游离晚期糖基化终末产物受体(esRAGE)是RAGE基因变异剪接体,可以捕获细胞外RAGE配体,阻断细胞表面RAGE活化,从而保护内皮细胞。本课题通过基因重组使人脐静脉内皮细胞(Huvec)过表达esRAGE。通过测定内皮细胞炎症因子NF-κB,凋亡相关蛋白bcl-2、Bax表达水平以及细胞凋亡情况,探讨esRAGE对AGEs诱导的内皮细胞凋亡的保护作用及其机制。方法:(1)通过慢病毒载体构建esRAGE基因过表达的Huvec:用过表达esRGAE的慢病毒感染Huvec,荧光显微镜下观察标记蛋白GFP(绿色荧光蛋白)表达情况;qRT-PCR检测病毒感染前后内皮细胞esRAGE的RNA表达水平,ELISA法测定病毒感染前后内皮细胞培养上清液中esRAGE蛋白质表达,以明确过表达esRAGE慢病毒是否成功转入Huvec。(2)不同浓度AGEs对Huvec凋亡的影响:三种浓度(50ug/ml,100ug/ml,200ug/ml)的AGEs、BSA,分别与人脐静脉内皮细胞孵育24h后。Hoechst-pi双染法对细胞进行染色,ipwin32软件计数凋亡细胞和总细胞,并算出细胞凋亡率。(3)过表达esRAGE对人脐静脉内皮细胞功能的影响:实验分为四组:对照组,AGEs组,AGEs+control-virus组,AGEs+Lv-esRAGE(esRAGE过表达慢病毒)组。qRT-PCR、western-blot检测前炎症因子NF-κB,凋亡相关蛋白bcl-2、Bax的RNA以及蛋白表达水平。结果:1.过表达esRAGE的人脐静脉内皮细胞株构建成功:a.慢病毒感染细胞GFP表达量达80%以上;b.过表达esRAGE的人脐静脉内皮细胞的RNA的表达量是正常细胞的1532倍;过表达esRAGE组,对照组细胞上清液的esRAGE蛋白浓度分别为:233.80ng/ml±12.764 vs 0.18ng/ml±0.005,P0.001。2.用三种浓度(50ug/ml,100ug/ml,200ug/ml)的AGE-BSA与内皮细胞共孵育24h后,细胞凋亡率随着AGEs浓度的升高而升高,细胞凋亡率分别为:(5.334+0.188)%vs(10.989+1.277)%vs(23.273+2.124)%,p0.001。提示AGE-BSA可以明显诱导内皮细胞凋亡,且凋亡率呈现浓度依赖性增高,故本课题采用200ug/ml AGEs作为诱导内皮细胞凋亡浓度。而BSA组中,三种浓度(50ug/ml,100ug/ml,200ug/ml)的BSA孵育内皮细胞24h后,细胞凋亡率分别为:(2.062+0.355)%vs(2.312+0.244)%vs(2.287+0.163)%,与空白对照组((2.058+0.210)%)比较,差异没有统计学意义,P=0.63。3.过表达esRAGE对人脐静脉内皮细胞功能的影响及机制探讨。3.1过表达esRAGE对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响:过表达esRAGE可以明显减少AGEs诱导的内皮细胞凋亡:AGEs+Lv-esRAGE(esRAGE过表达慢病毒)组的细胞凋亡率((2.151±0.002)%)明显低于AGEs组((23.273±0.021)%),P0.001。AGEs+control virus组的细胞凋亡率((23.667±0.031)%)与AGEs组((23.273±0.021)%)相比差异没有统计学意义,p=0.839。3.2过表达esRAGE对人脐静脉内皮细胞凋亡相关因子表达的影响:AGEs孵育上调凋亡相关因子Bax表达,下调抗凋亡因子bcl-2表达水平。过表达esRAGE可以下调AGEs诱导的Bax表达水平,上调bcl-2表达水平。与对照组比较,AGE-BSA组的Bax RNA表达水平上调(1.003±0.075 vs 1.346±0.095,p=0.001)。AGE-BSA组与AGE-BSA+control virus组之间比较差异没有统计学意义(1.346±0.095 vs 1.279±0.014,p=0.322)。而AGE-BSA+Lv-esRAGE组与AGE-BSA组对比,Bax RNA表达水平下调(0.981±0.033 vs 1.346±0.095,p0.001)。与对照组比较,AGE-BSA组的Bax蛋白表达水平上调(0.581±0.202 vs0.856±0.033,P=0.048)。AGE-BSA组与AGE-BSA+control virus组之间差异没有统计学意义(0.856±0.033 vs 1.013±0.091,p=0.221)。而AGE-BSA+Lv-esRAGE组与AGE-BSA组对比,Bax蛋白表达水平下调(0.432±0.077 vs 0.856±0.033,P=0.007)。四组间bcl-2 RNA表达水平差异没有统计学意义。与对照组比较,AGE-BSA组的bcl-2蛋白表达水平下调(0.720±0.086 vs 0.411±0.023,p=0.002)。AGE-BSA组与AGE-BSA+control virus组之间差异没有统计学意义(0.411±0.023 vs 0.383±0.074,p=0.704)。而AGE-BSA+Lv-esRAGE组与AGE-BSA组对比,bcl-2蛋白表达水平上调(0.755±0.081 vs 0.411±0.023,p=0.001)。3.3过表达esRAGE对人脐静脉内皮细胞炎症因子NF-кB表达的影响:AGEs孵育促进前炎症因子NF-кB的表达水平,过表达esRAGE组可以下调NF-кB的表达水平。与对照组比较,AGE-BSA组的NF-кB RNA表达水平上调(1.004±0.080vs 1.300±0.127,p=0.016);蛋白表达水平上调(0.470±0.025 vs 0.926±0.170,P=0.018)。AGE-BSA组与AGE-BSA+control virus组之间比较差异没有统计学意义,RNA(1.300±0.127 vs 1.260±0.119,p=0.690);蛋白质(0.926±0.170 vs 0.985±0.230,p=0.709)。而AGE-BSA+Lv-esRAGE组与AGE-BSA组对比,NF-кB RNA表达水平下调(0.918±0.041 vs 1.300±0.127,p=0.004);蛋白表达水平下调(0.410±0.109 vs 0.926±0.170,P=0.01)。结论:1、人脐静脉内皮细胞可以作为esRAGE基因载体,esRAGE基因转染后的Huvec细胞能够向外分泌esRAGE。2、AGEs能显著诱导Huvec细胞凋亡,明显增加Huvec细胞促凋亡因子Bax的表达,下调抗凋亡因子bcl-2的表达;过表达esRAGE可以明显减少AGEs诱导的内皮细胞凋亡,下调Bax表达水平,上调bcl-2表达水平。3、AGEs能诱导Huvec细胞发生炎症反应,明显增加Huvec细胞炎症因子NF-кB的表达水平,过表达esRAGE能够明显减轻AGEs诱导的细胞炎症反应,明显降低Huvec细胞NF-κB的表达。4、esRAGE对AGEs诱导的内皮细胞凋亡有保护作用,其保护机制主要通过下调促凋亡因子和炎症因子表达,上调抗凋亡因子表达。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2
【图文】：

1.1 细胞株人脐静脉内皮细胞(Huvec)委托上海中桥新舟购自 ATCC1.2 慢病毒表达系统基因信息基因名称：AGER(NM_001206940)物种：Human1.2.1 载体酶切载体信息:载体名称：GV367元件顺序：Ubi-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin克隆位点：AgeI/NheI载体图谱：

结果1 过表达 esRAGE 慢病毒转染细胞后 esRAGE 表达情况过表达 esRAGE 慢病毒，control 病毒转染 Huvec 细胞 72h 后，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况，发现绿色荧光蛋白表达量达 80%以上(图 3.1A)。为了进一步验证病毒感染效果，经 Puromycin 筛选出稳转株后，提取细胞 RNA，qRT-PCR 检测 esRAGE mRNA 表达水平。确实，esRAGE 慢病毒转染组较对照组表达明显增高，差异具有统计学意义(p<0.001)(图 3.1B)。另外，ELISA 法检测细胞培养上清中 esRAGE 蛋白浓度也发现 esRAGE 慢病毒转染组较对照组表达明显增高, 差异具有统计学意义(P<0.001)(图 3.1C)。表明过表达 esRAGE 慢病毒已成功转入 Huvec，且细胞向外分泌 esRAGE。

为了验证 AGE-BSA 对 Huvec 细胞的影响并确定最佳孵育浓度，分别应用三种浓度(50ug/ml,100ug/ml,200ug/ml)的AGE-BSA孵育人脐静脉内皮细胞24小时，Hoechst-pi 双染法对细胞进行染色，荧光显微镜下用 ZEN 软件观察并拍照,应用ipwin32 软件对总细胞以及凋亡细胞进行计数，测定各组细胞凋亡率。结果证明AGE-BSA 可以明显诱导内皮细胞凋亡，AGE-BSA 孵育组细胞凋亡率明显高于对照组，且凋亡率呈现浓度依赖性增高，差异具有统计学意义(p<0.001)(图 3.2.1A,B)，故本课题采用 200ug/ml 作为诱导内皮细胞凋亡浓度。另外，应用对应浓度的 BSA 孵育 Huvec 细胞，细胞凋亡率与对照组比较差异没有统计学意义(p>0.05)（图 3.2.1 A,B），证明 BSA 没有诱导内皮细胞凋亡的作用。

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本文编号：2781265