NRF2在白色脂肪棕色化中的作用及机制

发布时间：2020-08-07 14:01

【摘要】：第一部分NRF2敲除促进高脂诱导的肥胖及相关并发症目的:初步探索NRF2敲除与肥胖及相关并发症的关系方法:选取40只8周龄野生(WT)及核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)全身敲除(Nrf2~(~(-/-)))雄性小鼠,随机分成普食野生组(ND-WT)、普食敲除组(ND-Nrf2~(~(-/-)))、高脂野生组(HFD-WT)和高脂敲除组(HFD-Nrf2~(~(-/-))),每组10只。分别予以普通饲料(ND)及高脂饲料(HFD)喂养12周。称量小鼠体重、计算脂体比。HE染色评估脂肪细胞大小。IPGTT、IPITT实验了解糖耐量和胰岛素耐量。测量摄食量及肛温。能量代谢评估系统(CLAMS)分析活动量、氧气消耗量(VO_2)、二氧化碳产生量(VCO_2)、能量消耗(EE)及呼吸商(RER)。实时定量PCR技术(qPCR)检测腹股沟皮下白色脂肪组织(iWAT)中解偶联蛋白1(Ucp1)的mRNA表达。另一个体内实验中,选取20周龄的普食野生(ND-WT,n=3)、高脂野生型(8周龄开始HFD造模12周,HFD-WT,n=3)、普食db/db雄性小鼠(ND-db/db,n=3),qPCR检测iWAT中Nrf2的mRNA表达;蛋白免疫印迹(WB)检测iWAT中NRF2蛋白表达情况。结果:与HFD-WT组小鼠相比,HFD-Nrf2~(~(-/-))组的体重显著增加(p0.01)。与ND-WT小鼠相比较,HFD-WT小鼠及ND-db/db小鼠iWAT中Nrf2的mRNA表达水平显著下降(p0.05或p0.01),NRF2蛋白表达水平也降低了。与HFD-WT小鼠相比,HFD-Nrf2~(~(-/-))小鼠白色脂肪脂体比显著增加(p0.01),iWAT脂肪细胞更大。与HFD-WT小鼠相比,HFD-Nrf2~(~(-/-))小鼠IPGTT与IPITT多个时间点的血糖值均明显升高(p0.01)。与HFD-WT小鼠相比,HFD-Nrf2~(~(-/-))小鼠的肛温、VO_2、VCO_2及EE都是显著降低的(p0.05或p0.01),而摄食量、活动量及RER无明显差异。与HFD-WT小鼠相比,HFD-Nrf2~(~(-/-))小鼠iWAT中Ucp1的mRNA表达水平明显减少(p0.05)。结论:HFD诱导性及db/db肥胖小鼠iWAT中NRF2表达受到抑制。NRF2缺失加剧HFD诱导的糖代谢异常。NRF2敲除加剧HFD诱导的肥胖,这可能源于能量消耗降低及白色脂肪组织棕色化受抑制。第二部分NRF2促进白色脂肪棕色化目的:明确NRF2在促进白色脂肪棕色化中的作用。方法:选取32只8周龄WT及Nrf2~(-/-)雄性小鼠,随机分成室温野生组(RT-WT),冷刺激野生组(CR-WT),室温敲除组(RT-Nrf2~(-/-)),冷刺激敲除组(CR-Nrf2~(-/-)),每组8只。称量体重、计算脂体比。HE染色评估脂肪细胞大小。测量摄食、肛温。q PCR检测i WAT中Ucp1、Pgc-1α、Prdm16及其他白色向棕色脂肪转化相关基因的mRNA表达。另一个实验中,选取20只8周龄WT及Nrf2~(-/-)雄性小鼠,随机分成生理盐水注射野生组(Saline-WT)、异丙肾上腺素注射野生组(ISO-WT)、生理盐水注射敲除组(Saline-Nrf2~(-/-)),异丙肾上腺素注射敲除组(ISO-Nrf2~(-/-)),每组5只。HE染色评估脂肪细胞大小;q PCR检测i WAT中Ucp1、Pgc-1α、Prdm16等基因的mRNA表达。培养8周龄WT和Nrf2~(-/-)雄性小鼠i WAT来源的间质血管成分(SVF),棕色化诱导成熟后,q PCR检测脂肪细胞中Ucp1、Pgc-1α、Prdm16等基因的mRNA表达。结果:与CR-Nrf2~(-/-)组相比,CR-WT组的体重、白色脂肪脂体比都显著降低(p0.05或p0.01),i WAT脂肪细胞更小。与CR-WT组相比,CR-Nrf2~(-/-)组的肛温是显著降低的(p0.05或p0.01),而摄食量无明显差异。与CR-Nrf2~(-/-)组相比,CR-WT组小鼠i WAT中Ucp1、Pgc-1α、Prdm16等棕色化基因的mRNA表达水平明显升高(p0.01)。与ISO-Nrf2~(-/-)组相比,ISO-WT组小鼠i WAT脂肪细胞变小,i WAT中Ucp1、Pgc-1α及Prdm16基因的mRNA表达水平显著增加(p0.05或p0.01)。与Nrf2~(-/-)组相比,WT组脂肪细胞中Ucp1、Pgc-1α、Prdm16等基因的mRNA表达明显升高(p0.05或p0.01)。结论:体内实验显示:NRF2抑制了寒冷环境下体重的增加,促进了寒冷及ISO刺激诱导的白色脂肪棕色化。体外实验显示:NRF2促进白色脂肪细胞棕色化。第三部分NRF2调控白色脂肪棕色化的机制目的:探究NRF2促进白色脂肪棕色化的机制方法:培养8周龄WT和Nrf2~(-/-)小鼠i WAT来源的SVF,棕色化诱导及棕榈酸(PA)干预后,油红O染色检测脂肪细胞中脂滴的大小,q PCR、WB及免疫荧光染色(IF)检测脂肪细胞中Nrf2及Ucp1等基因的mRNA和蛋白表达。培养8周龄的WT和解偶联蛋白1全身敲除型(Ucp1~(-/-))小鼠i WAT来源的SVF,棕色化诱导及PA干预后,检测脂肪细胞中脂滴大小。培养WT和Ucp1~(-/-)小鼠i WAT来源的SVF,先转染Nrf2过表达慢病毒(Lv-Nrf2),再予以棕色化诱导及PA干预,油红O染色检测脂肪细胞脂滴大小,q PCR、WB及IF检测细胞中Nrf2和Ucp1基因的mRNA和蛋白表达水平。WT和Nrf2~(-/-)小鼠经冷刺激及ISO注射后,q PCR及WB检测i WAT中Nrf2、Sirt3及Ucp1基因的mRNA和蛋白表达水平。培养8周龄WT和NAD+依赖性的组蛋白去乙酰化酶家族成员3(Sirt3)全身敲除型(Sirt3~(-/-))小鼠i WAT来源的SVF,先转染Lv-Nrf2,再予以棕色化诱导,q PCR、WB及IF检测细胞中Nrf2、Sirt3及Ucp1基因的mRNA和蛋白表达水平。培养WT和Nrf2~(-/-)小鼠i WAT来源的SVF,先转染Sirt3过表达慢病毒(Lv-Sirt3),再予以棕色化诱导,q PCR、WB及IF检测细胞中Nrf2、Sirt3及Ucp1基因的mRNA和蛋白表达水平。结果:PA干预抑制了WT组脂肪细胞中Nrf2和Ucp1基因的mRNA(p0.05或p0.01)及蛋白的表达。NRF2缺失加剧了PA诱导的脂肪细胞内脂质累积,同时抑制了Ucp1等基因的mRNA(p0.01)及蛋白的表达。UCP1敲除加剧了PA诱导的脂肪细胞内脂质累积。NRF2过表达可以抑制PA诱导的WT组脂肪细胞中脂质累积,但这个效应却不存在于PA干预的Ucp1~(-/-)组中。寒冷及ISO刺激促进WT小鼠i WAT中Nrf2、Sirt3及Ucp1基因的mRNA(p0.01)和蛋白的表达。与WT组小鼠相比,寒冷及ISO刺激后,Nrf2~(-/-)小鼠i WAT组织中的Sirt3及Ucp1基因的mRNA表达水平明显减少(p0.01),蛋白水平也是降低的。与WT+Con组脂肪细胞相比,WT+Lv-Nrf2组脂肪细胞中Nrf2、Sirt3和Ucp1基因的mRNA表达的显著增加(p0.01),蛋白表达亦增加。与Sirt3~(-/-)+Con组脂肪细胞相比,Sirt3~(-/-)+Lv-Nrf2组脂肪细胞的Nrf2基因的mRNA(p0.01)和蛋白都增加了,Sirt3基因的mRNA和蛋白均难以检测到,Ucp1基因的mRNA表达略有增加(p0.01)。与WT+Lv-Nrf2组脂肪细胞相比,Sirt3~(-/-)+Lv-Nrf2组脂肪细胞Ucp1基因的mRNA(p0.01)和蛋白表达水平均明显降低了。与WT+Con组脂肪细胞相比,WT+Lv-Sirt3组脂肪细胞中Sirt3和Ucp1基因的mRNA表达的显著增加(p0.01),蛋白表达亦增加;与Nrf2~(-/-)+Con组相比,Nrf2~(-/-)+Lv-Sirt3组脂肪细胞的Sirt3和Ucp1基因的mRNA表达显著增加(p0.01),蛋白表达亦明显增加。结论:PA干预抑制了WT脂肪细胞中NRF2的表达。NRF2敲除加重了PA诱导脂肪细胞内脂质聚集。NRF2抑制PA诱导的脂肪细胞内脂质累积需要UCP1的存在。NRF2可以部分通过SIRT3通路调控白色脂肪棕色化,进而影响脂质在脂肪细胞内的聚集,但也存在其他的信号通路。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R589.2
【图文】：

ND-Nrf2-/-组的体重为1.39±0.04，见图1.1；HFD-Nrf2-/-组体重显著高于HFD-WT组，见图1.2。表1.1小鼠体重增长变化Table1.1 Changes of body weight in mice周龄（w） ND-WT ND-Nrf2-/-HFD-WT HFD-Nrf2-/-8 19.78±0.75 20.38±0.82 20.57±0.69 20.30±1.029 21.02±0.41 21.87±0.50 21.23±0.67 21.33±0.6610 22.00±0.76 22.67±0.61 22.67±0.69 23.02±0.8211 23.15±0.84 23.70±0.74 24.00±0.89 25.02±0.98#12 23.93±0.94 24.47±0.89 24.95±0.7926.57±0.89##▲13 24.72±1.12 25.08±0.85 25.93±0.75 28.53±0.88##▲▲14 25.10±1.07 25.40±0.79 27.33±1.00*30.40±1.42##▲▲15 26.32±0.95 26.73±1.13 28.82±0.87**32.87±1.26##▲▲16 26.75±0.99 27.37±0.92 30.42±0.98**33.77±1.09##▲▲17 27.35±0.76 27.83±0.78 31.13±1.44**35.20±1.33##▲▲18 27.78±0.86 28.18±1.01 32.13±0.88**37.32±1.36##▲▲19 27.90±1.33 28.65±0.97 32.95±0.81**38.63±1.37##▲▲20 28.10±1.43 28.87±1.02 33.75±0.97**40.05±1.30##▲▲(Mean ± SD, n = 6)*p＜0.05 or**p＜0.01 vs ND-WT;#p＜0.05 or##p＜0.01vsND-Nrf2-/-;▲p＜0.05 or▲▲p＜0

-/-组体重显著高于HFD-WT组，见图1.2。表1.1小鼠体重增长变化Table1.1 Changes of body weight in mice周龄（w） ND-WT ND-Nrf2-/-HFD-WT HFD-Nrf2-/-8 19.78±0.75 20.38±0.82 20.57±0.69 20.30±1.029 21.02±0.41 21.87±0.50 21.23±0.67 21.33±0.6610 22.00±0.76 22.67±0.61 22.67±0.69 23.02±0.8211 23.15±0.84 23.70±0.74 24.00±0.89 25.02±0.98#12 23.93±0.94 24.47±0.89 24.95±0.7926.57±0.89##▲13 24.72±1.12 25.08±0.85 25.93±0.75 28.53±0.88##▲▲14 25.10±1.07 25.40±0.79 27.33±1.00*30.40±1.42##▲▲15 26.32±0.95 26.73±1.13 28.82±0.87**32.87±1.26##▲▲16 26.75±0.99 27.37±0.92 30.42±0.98**33.77±1.09##▲▲17 27.35±0.76 27.83±0.78 31.13±1.44**35.20±1.33##▲▲18 27.78±0.86 28.18±1.01 32.13±0.88**37.32±1.36##▲▲19 27.90±1.33 28.65±0.97 32.95±0.81**38.63±1.37##▲▲20 28.10±1.43 28.87±1.02 33.75±0.97**40.05±1.30##▲▲(Mean ± SD, n = 6)*p＜0.05 or**p＜0.01 vs ND-WT;#p＜0.05 or##p＜0.01vsND-Nrf2-/-;▲p＜0.05 or▲▲p＜0.01 vs HFD-WT

图 1.3 WT小鼠普食高脂造模后iWAT中Nrf2基因的mRNA和蛋白表达水平Fig 1.3 The mRNA (left) and protein (right) levels of Nrf2 in iWAT from 20-week-old WTmicefed a ND or HFD diet for 12 weeks.(Mean ± SD, n = 3 for mRNA and n=2 for protein) *p＜0.05vs ND-WT.图 1.4普食喂养WT和db/db小鼠iWAT中Nrf2基因的mRNA和蛋白表达水平

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本文编号：2784093