PGE2及其受体信号对佐剂性关节炎大鼠树突状细胞和成纤维样滑膜细胞的影响及CP-25的作用

发布时间：2020-08-09 15:36

【摘要】：类风湿类节炎(RA)是一种慢性、系统性自身免疫病,成纤维样滑膜细胞(FLS)类肿瘤样增生是RA的特征性病理表现,树突状细胞(DCs)作为功能强大的抗原提呈细胞,在炎症免疫反应中起重要作用。DCs上有前列腺素受体(EP)四种亚型的表达,但RA DCs上EP不同亚型的表达情况及其对DC功能的调控尚不清楚；前列腺素E2 (PGE2)是引起FLS异常增殖的重要分子之一,PGE2通过G蛋白偶联的EP信号通路调节细胞内环磷酸腺苷(cAMP)水平是滑膜细胞异常增殖的重要机制,G蛋白偶联受体激酶(GRKs)是G蛋白偶联受体(GPCRs)的负性调节剂,可特异性地活化GPCRs,使其磷酸化,从而介导受体脱敏,但FLS对EP信号尤其是对EP4信号的的调节未见报道。课题组将白芍总苷(TGP)的活性单体芍药苷(Pae)进行酯化修饰,得到的新型活性单体-苯磺酰芍药苷(芍药苷-6-氧-苯磺酸酯,代号CP-25)具有一定的抗炎作用。然而CP-25对免疫性关节炎是否具有治疗作用,其作用机制如何,还不清楚。本课题在以往研究工作基础上,建立大鼠佐剂性关节炎(AA)模型,以DCs和FLS为研究细胞,运用流式细胞术、QRT-PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、激光共聚焦、小干扰RNA等技术,观察PGE2对DCs和FLS功能的影响及CP-25的作用,为揭示PGE2及其信号转导参与RA异常炎症免疫反应的病理机制及CP-25的作用靶点提供实验依据。目的：观察PGE2及其信号对大鼠DCs和FLS功能的影响及CP-25对大鼠AA的治疗作用及机制,为揭示PGE2及其信号转导参与RA异常炎症免疫反应的病理机制以及CP-25的作用靶点提供实验依据。方法：采用完全弗氏佐剂制备大鼠AA模型,取大鼠骨髓源细胞,经rIL-4、rGM-CSF刺激诱导生成骨髓源DCs; QRT-PCR法检测EP mRNA各亚型的表达。流式细胞术检测DCs抗原摄取功能和表型CD80, CD86, CD40和MHCⅡ的表达及FLS表面EP4和GRK2的表达；DCs与T细胞的混合淋巴细胞反应(MLR)和FLS的增殖采用CCK-8法检测；ELISA法检测PGE2, IL-1β, TNF-α, IL-12, IL-23和cAMP的水平；CP-25灌胃给药,进行多发性关节炎指数评分；HE染色观察关节病理；激光共聚焦显微观察法检测EP4和GRK2在FLS上的分布；免疫共沉淀法检测FLS上EP4和GRK2的相互作用；siRNA瞬时沉默FLS中GRK2基因表达；Western blot法检测EP4和GRK2在FLS胞膜表达。结果：1.PGE2信号对AA大鼠DCs功能的影响大鼠骨髓源DCs表达EP的四种亚型,与正常大鼠相比较,AA模型大鼠骨髓源DCs上EP4 mRNA表达明显上调。在AA大鼠病程研究中发现,骨髓源DCs分泌的PGE2, TNF-α, IL-23等炎症介质和细胞因子在AA大鼠继发性炎症高峰期和缓解期均较致炎前显著升高；外周血CD103+细胞中DC共刺激分子CD40和CD86在d7就较致炎前升高,CD80和MHCⅡ在继发性炎症初始阶段(d17)开始增加,而在BMDCs中,MHCⅡ、 CD86和CD40均在原发性炎症阶段(d7)就开始升高,随着炎症的加重,这些DCs表型表达均显著升高。提示,在AA炎性进程中,PGE2、 EP及DC表型出现异常变化。体外进一步模拟AA炎性环境,在TNF-α刺激下,观察PGE2对DCs功能的影响,结果发现PGE2刺激组DCs的抗原摄取能力明显降低,PGE2可浓度依赖性的增加DCs的IL-23分泌,同时,显著增加DCs的IL-12分泌,增加DCs对T细胞的刺激能力。EP4激动剂CAY10598可模拟PGE2对DCs的效应,增强DCs对T淋巴细胞的刺激能力,上调DCs表面CD80的表达,而EP2激动剂Butaprost和CAY10598可促进DCs的IL-23分泌,上调MHCⅡ和CD86的表达,但EP1和EP3激动剂Sulprostone对这些功能没有影响。cAMP类似物dbcAMP增加DCs的IL-23、L-12产生和MHCⅡ及共刺激分子(CD80, CD86)的表达,说明PGE2/EP4-cAMP信号介导的DCs功能异常参与了AA炎症反应。研究还发现PI3K抑制剂上调了PGE2诱导DCs的IL-23和IL-12产生,但抑制了DCs表面MHCⅡ及共刺激分子(CD80, CD86)的表达,PI3K参与PGE2调控DCs功能的机制有待进一步研究。2.PGE2信号对AA大鼠FLS功能的影响TNF-α在AA大鼠早期炎症反应即开始升高,在炎症高峰期(d23)和炎症缓解期(d30), PGE2和TNF-α均较致炎前高。PGE2可浓度依赖性的刺激FLS增殖,10μM时刺激作用最强。Western blot和流式检测均提示AA大鼠FLS胞膜蛋白EP4显著降低；GRK2在胞膜中表达显著升高。那么GRK2的高表达是否与胞膜EP4降低有关呢?我们用PGE2刺激AA大鼠FLS,结果发现GRK2在PGE2刺激10 min就开始升高,随着刺激时间的延长,GRK2表达呈上升趋势。而EP4在PGE2刺激20 min开始表达升高,2 h左右达高峰,12 h时表达较未刺激时降低。为进一步分析FLS胞膜EP4减少的原因,先用PGE2 (10μM)预刺激30 min,可升高FLS细胞膜上EP4表达,然后在PGE2基础上再用EP4激动剂刺激FLS,结果发现EP4激动剂可逐渐降低胞膜EP4表达,刺激30min时低于基础水平,而胞膜GRK2表达逐渐升高。与对照组相比较,TNF-α组在同等条件下EP4表达降低更明显,GRK2表达却逐渐升高。其下游信号分子cAMP经PGE2预刺激可明显增加,但随着EP4激动剂刺激时间的延长,cAMP水平逐渐降低,30 min时低于未刺激组,1h时cAMP浓度降低有统计学差异。TNF-α组在同等条件下,cAMP 水平降低更明显,提示在TNF-α炎性细胞因子作用下,EP4激动剂可进一步促进EP4的脱敏,从而导致下游信号cAMP水平的降低。激光共聚焦显微镜观察FLS,发现EP4和GRK2主要分布在胞浆和胞膜,经共定位显示Overlap Coeffcient为0.6595,提示EP4和GRK2存在一定的相互作用；免疫共沉淀法进一步显示,在正常情况下,GRK2-EP4有比较弱的作用,EP4激动剂刺激1h显著增加GRK2的表达,提示GRK2-EP4的相互作用增强。为进一步探讨GRK2在EP4异常脱敏中的作用及PGE2对FLS功能的影响,用siRNA沉默GR.K2基因表达后,发现可取消PGE2引起的FLS异常增殖,EP4在激动剂刺激下逐渐向细胞膜聚集,随着刺激时间的延长EP4胞膜表达逐渐升高。经PGE2预刺激的FLS再用EP4激动剂刺激30 min和24 h的胞内产生cAMP水平与未刺激的GR.K2基因沉默FLS相比无显著性差异。这些结果表明GRK2在调节滑膜细胞异常增殖中发挥了重要的作用,其可能通过促进EP4脱敏,导致下游信号分子cAMP水平降低从而引起FLS的异常增殖。3.CP-25对大鼠AA的治疗作用及部分机制CP-25可明显降低AA大鼠的多发性关节炎指数评分,可不同程度的改善关节病理变化,主要表现为炎性细胞浸润减少,滑膜细胞增生减轻,炎性渗出和血管翳形成减少,滑膜组织破坏软骨、骨罕见。表明CP-25对大鼠AA具有治疗作用。CP-25可不同程度降低PGE2和TNF-α水平,降低AA大鼠FLS的异常增殖反应。CP-25可显著下调DCs表面MHCⅡ, CD40和CD80的表达,但对CD86的表达无明显影响。CP-25体外给药可提高DCs的吞噬能力,下调CD80, CD86和MHCⅡ的表达,抑制对T细胞的增殖作用,不同程度的抑制IL-23分泌。CP-25体外给药可不同程度抑制FLS的增殖,且呈明显的浓度效应关系。CP-25可显著升高胞膜EP4的表达,同时不同程度抑制胞膜GRK2表达。进一步在体外把DCs和FLS按一定比例进行接触式混合培养,以部分模拟体内的环境,结果发现,PGE2处理的DCs可显著促进FLS的增殖,增加FLS分泌IL-1β, CP-25体外给药可不同程度抑制FLS的增殖及细胞因子的分泌。此外,把PGE2处理的FLS与DCs按1比10比例进行混合培养,发现PGE2处理的FLS,可显著促进DCs分泌TNF-α,而CP-25处理的FLS可抑制DCs分泌TNF-α,体外实验进一步证实了CP-25可以改善FLS和DCs的功能,提示CP-25可能通过调节AA大鼠异常的免疫功能和抑制FLS的异常增殖而发挥治疗作用。结论：1.PGE2及其EP4-cAMP信号亢进导致AA大鼠DCs功能异常活化,并与病程相关；2.AA大鼠PGE2异常升高,导致EP4膜表达下降(过度脱敏),与FLS异常增殖以及与FLS和DCs的相互活化有关；3.AA大鼠FLS的GRK2异常升高,并EP4共表达,可能是导致EP4脱敏的主要原因；4.CP-25对大鼠AA的治疗作用与其改善DCs功能、抑制FLS异常增殖和分泌炎症因子有关,该作用可能是通过降低FLS GRK2膜表达和上调EP4膜表达,抑制EP4的过度脱敏实现的。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R593.22

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