无能B细胞免疫耐受状态紊乱参与系统性红斑狼疮发病机制的研究

发布时间：2020-08-10 07:32

【摘要】：目的:系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多系统累及的慢性自身免疫性疾病。SLE发病的中心环节是自身反应性B细胞激活,生成大量针对细胞核、细胞浆以及其他细胞成分的自身免疫性抗体。无能B细胞是存于外周循环系统中通过克隆无能机制达到免疫耐受状态的具有自身反应性的一群B淋巴细胞,具有发展成为致病性自身反应性B细胞的潜能。以CD19+CD27-Ig D+Ig M-/low为表面标记的BND细胞是目前公认的无能B细胞标记。文献报道,BND细胞免疫耐受状态的紊乱与类风湿关节炎、1型糖尿病等自身免疫性疾病的发病相关。但是,有关SLE患者的BND细胞研究较少。本研究对SLE患者BND细胞免疫耐受状态进行了检测,并对其免疫耐受状态紊乱的机制进行了探索。方法:1.利用流式细胞术检测SLE患者和健康对照外周血BND细胞比例,并将患者BND细胞比例与临床指标进行相关性分析;2.利用流式细胞术检测SLE患者外周血BND细胞表面CD分子、BCR刺激后钙离子内流水平、BCR刺激后胞内酪氨酸磷酸化升高程度,用以评估SLE患者外周血BND细胞免疫耐受状态;3.流式分选SLE患者和健康对照的BND细胞以及CD19+CD27-Ig D+Ig M+B细胞,并进行转录组测序以了解BND细胞的转录组学特征;4.通过SLE患者和HC血浆交叉培养实验、血浆细胞因子差异检测、以及Th1/Th2/Th17细胞因子体外刺激实验明确对BND细胞起调控作用的细胞因子;5.通过分析SLE患者血浆IL-4表达水平与临床指标相关性、全基因组关联分析(GWAS)明确IL-4是否与SLE发病相关;6.建立无能B细胞体外模型以便进行功能研究;7.利用无能B细胞体外模型,探索IL-4对无能B细胞的调控作用;8.使用免疫共聚焦显微镜、间接标记流式细胞术、荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹技术探索IL-4对无能B细胞免疫耐受调节的机制。结果:1.与健康对照相比,SLE患者外周血BND细胞比例降低,且SLE患者外周血BND细胞比例与疾病活动度负相关,糖皮质激素治疗能够上调患者BND细胞比例;2.SLE患者外周血BND细胞表面CD80、CD86、CD95和CD71与健康对照无明显差异;BCR刺激后,SLE患者BND细胞的钙离子内流水平和酪氨酸磷酸化升高程度均比健康对照升高,表明其BCR信号通路的应答能力增强,提示SLE患者BND细胞免疫耐受状态紊乱,处于相对活化状态;3.转录组测序分析提示,SLE患者的BND细胞在细胞活化、增殖、分化相关基因的表达与健康对照存在差异;功能以及通路分析提示SLE患者的BND细胞在活化、免疫调控、细胞因子-细胞因子受体相互作用等方面与健康对照存在差异;4.SLE患者血浆高表达IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ,且只有IL-4能在体外培养时降低外周血BND细胞比例;5.SLE患者血浆IL-4表达水平与SLEDAI评分正相关,与补体C3、C4负相关;GWAS分析提示IL-4与SLE疾病相关;6.抗CD79b单克隆抗体可以在体外诱导na?ve B细胞成为无能B细胞;7.IL-4可以上调无能B细胞表面Ig M从而逆转无能B细胞免疫耐受状态;8.IL-4通过促进内化的Ig M再循环到细胞表面以及促进Ig M的新合成而上调细胞表面Ig M,且这种作用是通过p-STAT6介导的。结论:我们的研究明确了SLE患者外周血BND细胞比例降低,且BND细胞比例与SLE疾病活动度相关,是潜在的疾病活动度评价指标。SLE患者BND细胞的BCR信号通路的应答能力高于健康对照,表明SLE的BND细胞的免疫耐受状态紊乱,处于相对活化状态。我们首次对健康人以及SLE患者的BND细胞进行了转录组学研究,探索了无能相关的基因及通路,为深入探索无能B细胞免疫耐受机制打下了基础。此外,我们发现SLE患者血浆中高表达的IL-4可以通过上调BND细胞表面Ig M的表达,实现对BND细胞免疫耐受状态的逆转。而且IL-4是通过增加p-STAT6的表达而促进内化的Ig M再循环到细胞表面以及促进Ig M的新合成来逆转无能B细胞免疫耐受状态。我们的研究为SLE的治疗寻找了新的治疗策略,即可以通过诱导外周B细胞无能或者靶向阻断IL-4信号通路来治疗系统性红斑狼疮。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R593.241
【图文】：

实验结果一、SLE外周血 BND细胞比例与疾病活动度相关性分析（一）SLE 患者外周血 BND细胞比例低于 HC为比较 SLE 患者与健康对照外周血 BND细胞比例是否存在差异，我们将两组的外周血用密度梯度离心法分离后，按照 Duty等人[13]使用的流式设门方法，利用流式细胞仪检测外周血 BND细胞占 B 细胞的百分比，进而比较 SLE 患者与健康对照之间的差异。流式设门方法见图 1，首先用 CD19 圈出 B细胞；然后用 CD27和 IgD将 B细胞划分为 CD19+CD27-IgD+幼稚 B 细胞（na ve B cells）、CD19+CD27+记忆 B细胞（memory B cells）、CD19+CD27-IgD-双阴性 B细胞（DN B cells）；na ve B细胞根据表面 IgM 表达划分为 BND细胞（CD19+CD27-IgD+IgMlo/-）和 CNB 细胞（CD19+CD27-IgD+IgM+）。

HC SLE p-valueNo. of subjects 46 40 -Sex (male:female) 5:41 4:36 >0.9999Age (years) 37.5 (24, 45.25) 35.3 (24, 43.75) 0.5589BNDcells/na ve B cells (%) 3.17 (1.69,4.66 ) 0.85 (0.16, 2.35) <0.0001BNDcells/B cells (%) 1.65 (1.00, 2.56) (0.33, 0.1, 3.17) <0.0001Na ve B cells/B cells (%) 58.6 (44.48, 67.55) 49.6 (29.75, 76.3) 0.304Memory B cells/B cells (%) 27.46 (19.63, 40.9) 32.69 (13.2, 45.6) 0.687DN B cells/B cells (%) 12.05 (9.03, 17.15) 12.9 (5.93, 19.55) 0.916B cells/Lymphocytes (%) 2.31 (1.85, 4.83) 2.72 (1.58, 5.88) 0.947BNDcells：无能 B 细胞；DN B cells：双阴性 B 细胞。计量资料采用 Mann-WhitneyU test 进行统计；计数资料采用 Fisher’s exact test 进行统计，p<0.05 认为存在统计学差异

无能 B细胞免疫耐受状态紊乱参与系统性红斑狼疮发病机制的研究（二）SLE 患者外周血 na ve B 细胞表面 IgM 表达水平高于 HC因为细胞表面 IgM 的低表达是无能 B细胞的特征，所以 SLE患者中 BND细胞比例的降低与 na ve B细胞表面 IgM 表达升高应该保持一致。于是，我们比较了 HC 和SLE 患者 na ve B 细胞表面 IgM 的平均荧光强度（MFI）。结果显示：SLE 患者na ve B 细胞表面 IgM 的表达水平高于 HC 组，差异具有统计学意义（图 3B，p<0.0001）；作为对比，SLE 患者 na ve B 细胞表面 IgD 的表达水平与 HC 组差异没有统计学意义（图 3A）。

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