NR4A1调控的线粒体分裂和线粒体自噬在心肌微循环再灌注损伤中的机制研究

发布时间：2020-08-10 21:42

【摘要】：背景:急性心梗对心肌的破坏包括缺血损伤和再灌注损伤两部分。在过去二十年里,大量的研究都将关注点聚焦在心肌细胞的再灌注病理损伤机制中,而忽视了心肌上游的微循环破坏。而在微循环稳态调控中,线粒体起着不可替代的作用。线粒体通过自身的损伤性分裂和保护性自噬清除,对再灌注损伤信号进行修饰,将胞外信号传递给内皮细胞,介导内皮的凋亡或存活,从而精确调节微循环的结构和功能。但现在仍不清楚的是,线粒体分裂和线粒体自噬是如何调控微循环再灌注损伤。不仅如此,近期的研究证实了线粒体分裂过程主要受到线粒体分裂因子(Mff)的调控,而Mff介导的损伤性线粒体分裂是如何通过下游事件最终启动内皮凋亡也没有详细的实验报道;除此之外,FUNDC1是新型的线粒体自噬调节受体,而FUNDC1激活的保护性线粒体自噬是如何维持线粒体稳态和内皮功能,还未见报道。最后,我们前期研究证实了 NR4A1参与到代谢性肝损伤的线粒体分裂和自噬调控中,而NR4A1是否有能力在心肌再灌注损伤条件下,差异性调节线粒体分裂和自噬还不得而知。目的:本研究旨在阐明心肌缺血再灌注介导微循环损伤的分子机制,探究Mff介导的线粒体分裂诱发微循环破坏的信号过程,明确FUNDC1介导的线粒体自噬修复微循环损伤的保护机制,寻找线粒体分裂和线粒体自噬的上游调节信号。方法:利用WT小鼠、NR4A1敲除小鼠(NR4A1KO)以及Mff敲除小鼠MffK-o体外建立心肌再灌注损伤模型。同时从上述老鼠心脏组织中分离心肌微循环内皮细胞(CMEC),在体外建立缺氧复氧损伤模型。动物水平,利用免疫组化、免疫荧光、western blot、免疫共沉淀、qPCR、超微结构电镜等实验方法,观察微循环舒张功能、屏障功能、管腔结构、内皮凋亡等变化;细胞水平,利用线粒体提取、qPCR技术、荧光探针、western blot、病毒过表达、突变质粒转染、干扰RNA敲低、电镜、免疫荧光共定位染色、免疫共沉淀、高效薄层色谱法等技术,观察线粒体DNA转录和表达、能量代谢、线粒体ROS生成、线粒体cyt-c渗出、心磷脂氧化、线粒体膜电位、mPTP开放、HK2解离、线粒体和溶酶体融合(线粒体自噬)、线粒体分裂、线粒体凋亡通路等变化。从而明确NR4A1对微循环再灌注损伤的调控作用、阐明Mff介导的线粒体分裂诱发内皮死亡的具体过程、确立FUNDC1调控的线粒体自噬,保护线粒体稳态和内皮活性的信号机制。结果:1.再灌注条件下,NR4A1在微循环中的表达含量显著上升,而敲除NR4A1后可以显著降低微循环灌注缺损和内皮凋亡。2.结构功能上,抑制NR4A1后可以恢复内皮的屏障功能、舒张功能并减轻局部炎症反应。3.分子水平上,NR4A1促进Mff的磷酸化激活,从而诱发线粒体过度分裂;NR4A1下调FUNDC1的活性,进而压制线粒体自噬;4.线粒体分裂的激活和线粒体自噬的失活,共同促进了内皮细胞死亡和微循环再灌注损伤密切相关。5.机制上,Mff调控的线粒体分裂,也可通过诱发线粒体基因组的转录和表达下调,从而造成线粒体ROS的大量蓄积,诱发心磷脂的氧化,促进凋亡因子细胞色素c(cyt-c)的释放。6.不仅如此,Mff调控的线粒体分裂,也会通过诱发线粒体外膜VDAC1蛋白的寡聚化,从而促进抗凋亡因子HK2的解离,造成mPTP的持续开放,加速cyt-c向胞浆渗漏。7.渗漏至胞浆的cyt-c可以通过启动线粒体凋亡通路,激活内皮细胞的自杀程序。8.而在体水平敲除Mff,可以减轻内皮细胞凋亡、对抗微循环再灌注损伤。9.与损伤性线粒体分裂相反,FUNDC1介导的线粒体自噬,可以通过促进线粒体碎片的清除,纠正过度的线粒体分裂,封闭线粒体凋亡通路,最终促进内皮存活。结论:1.再灌注损伤通过上调NR4A1,诱发内皮线粒体的损伤以及微循环结构和功能的破坏;2.异常表达的NR4A1通过提高Mff的磷酸化,从而激活损伤性线粒体分裂;3.高表达的NR4A1通过限制FUNDC1的激活,从而压制保护性线粒体自噬;4.Mff介导的线粒体分裂,通过激活mROS/cardiolipin/cyt-c和VDAC1/HK2/mPTP信号通路,最终促进cyt-c向胞浆渗漏,启动线粒体依赖的内皮死亡,加重微循环再灌注损伤;5.FUNDC1调控的线粒体自噬,通过清除线粒体碎片,对抗线粒体分裂,从而维持线粒体的结构和功能,降低再灌注内皮损伤,维持微循环稳态。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R54
【图文】：

流程图,目标区域,测序,流程图

ＩＬ５逦ＩＬ６逦ＣＸＣＬ１逦ＳＥＲＰＩＮＢ２逦ＰＬＡ２Ｇ７逦ＨＡＶＣＲ２逡逑ＤＰＰ１０逡逑３．５血标本懫集及全血ＤＮＡ提取：逡逑血标本懫集前与受试者本人签署知情同意书，均于空腹时抽取外周静脉血，逡逑５ｍｌ静脉血收集于ＥＤＴＡ真空负压抗凝管中，混匀后平均分装于５支冻存管并逡逑保存于－８０°Ｃ冻存备用，提取全血ＤＮＡ。待所有受试者标本集齐后，应用天根生逡逑化公司的血液基因组提取试剂盒（货号：ＤＰ邋３４８）抽提全血ＤＮＡ，操作步骤按说逡逑明书进行，懫集的全血ＤＮＡ存于１．５ｍｌ邋ＥＰ管中并于－２０°Ｃ保存。干冰运输送检逡逑行目标区域高通量测序（委托第三方４若禾致源生物信息科技有限公司进行）。逡逑３．６．目标区域捕获联合二代高通量测序流程：逡逑诺禾致源公司首先对送检的ＤＮＡ样品进行检测，通过琼脂糖凝胶电泳分析逡逑及Ｑｕｂｉｔ荧光计精确定量，对于ＤＮＡ含量在０．５ｕｇ以上的样品被用来建库捕获、逡逑文库质检并进入Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋Ｈｉｓｅｑ邋２０００平台高通量测序流程，测序流程如图１－１－１。逡逑逦逦逦＂逦＇

凝胶电泳,浓度,样品,电压

逦解放军医学院博士学位论文逦逡逑３．６．１．测序标本质检：逡逑（１）逦应用琼脂糖凝胶电泳法分析ＤＮＡ完整性及纯度；逡逑检测参数：逡逑基因组ＤＮＡ—胶浓度：１％电压：１００ｖ电泳时间：４０ｍｉｎ逡逑ＰＣＲ产物——胶浓度：２％邋电压：８０ｖ逦电泳时间：５０ｍｉｎ逡逑ｌ0ｘ邋ｌｉｂｒａｒｙ－－－胶浓度：１％邋电压：６ｖ邋电泳时间：１８ｈ逡逑凝胶电泳检测结果：如图１－１－２。逡逑

工作流程图,探针,工作流程图,目标区域

逦解放军医学院博士学位论文逦逡逑盒所推荐实验用品及操作流程进行，实验基本流程见图１－１－３。逡逑３．６．３．上机测序：应用设计的Ａｇｉｌｅｎｔ液相芯片目标区域捕获探针，对获得的逡逑ＤＮＡ序列进行高效富集，随后在ＩｌｌＵｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００平台测序。目标区域捕获逡逑探针＋测序工作流程见图１－１－３。逡逑ＤＮＡ逡逑

【参考文献】