短期高脂饮食诱导β细胞复制及β细胞对α细胞功能调节作用的研究

发布时间：2020-08-12 14:50

【摘要】：糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种由多种病因引起的以血糖增高为特点的慢性代谢紊乱性疾病。是由胰岛素分泌和作用缺陷引起的。其中多为2型糖尿病(T2DM),占糖尿病患者的90%以上。糖尿病可以发生在任何人的任何人生阶段。随着社会经济的持续发展,人类生活水平的不断提高,人们的饮食结构与生活习惯的改变,肥胖率上升,同时伴随着人口的老龄化,糖尿病的发病率呈逐年快速增长的趋势。据统计在过去的十年间,全球糖尿病患病率增长超过50%,2017年全球糖尿病患者已逾4.22亿,严重威胁着人类的生命与健康。而在我国,成年人糖尿病患病率也高达10.9%,且有约15.5%的人群处于糖尿病前驱阶段。因此,寻找糖尿病的危险因素,并且及早的进行干预与预防已成为我国的重大公共安全问题。有研究表明糖尿病的发生与发展和饮食习惯有着极其密切的关系,不健康的饮食,例如高脂饮食,被认为是发生糖尿病、肥胖等疾病的主要危险因素。以饱和脂肪酸为代表的脂肪摄入过量,被证实与糖尿病的发生密切相关。2型糖尿病大部分患者以胰岛素抵抗为主,病人多肥胖。近年来的研究表明,在啮齿动物和人类中都观察到了胰岛β细胞群对肥胖的适应性,有尸检显示,其在肥胖患者体内增殖高达50%。在高脂饮食条件下,β细胞的增殖代表了细胞的自然适应过程,长期高脂饮食后的代偿性β细胞增殖被认为是继发于由肝原性系统因素所引起的胰岛素抵抗。然而,最近的研究已经揭示,在小鼠开始高脂喂养的几天后,即开始出现了β细胞增殖,不论是否出现胰岛素抵抗,这一现象暗示了潜在的替代机制。巨噬细胞(Macrophages,M?)属于免疫细胞,来源于血液中的单核细胞,通过骨髓释放入血液的单核细胞,在血液中经过3~4天,进入组织以及浆膜腔,进而转变为巨噬细胞。在生理状态下,器官组织中存在少量的巨噬细胞,发挥特异性与非特异性免疫作用。近年来人们对于巨噬细胞的研究表明,巨噬细胞是一类具有可塑性和多功能性的细胞,在体内外微环境的影响下,表现出明显的功能差异。同时还有研究表明胰岛内的固有巨噬细胞能够分泌各种因子参与胰岛发育和组织重塑过程。目前,可根据巨噬细胞的活化状态及其所发挥的功能不同,将巨噬细胞主要分为经典活化的巨噬细胞即M1型(Classicallyactivated Macrophage)和替代性活化的巨噬细胞即M2型(Alternativelyactivated Macrophage)。在免疫炎症反应中,促炎的M1型巨噬细胞与抑制炎症反应的M2型巨噬细胞处于一种抗炎和促炎的平衡状态。在许多慢性炎症疾病中,例如糖尿病、动脉粥样硬化等,这种平衡被打破,巨噬细胞将持续浸润、活化并可能使抑制炎症的机制受到破坏,使得病情进一步发展。已经有各种报告描述了2型糖尿病(T2D)和非肥胖的啮齿类动物T2D模型中胰腺和胰岛炎症的增加。非糖尿病性非典型灵长类动物(NHPS)在长期高脂饮食所引起的胰岛素抵抗的早期阶段(12)个月也显示了在胰腺组织中胰岛相关巨噬细胞数量的增加并伴随着相关细胞因子表达的增加。这些发现提示局部炎症在代谢性疾病胰岛功能损害中的作用。人类的胰岛细胞按其染色和形态学特点,主要分为胰岛α细胞、β细胞、delta细胞及PP细胞。其中α细胞约占胰岛细胞的20%。当血糖降低时,胰岛α细胞可分泌胰高血糖素,以升高血糖;当血糖升高时,则分泌减少,与β细胞分泌的胰岛素共同作用,维持体内血糖平稳。在早期糖尿病病理生理机制的探索过程中,人们常常将关注点放在分泌胰岛素的胰岛β细胞上,而忽视了分泌胰高血糖素的胰岛α细胞。我们假设短期高脂饮食可以诱导胰岛巨噬细胞浸润,并且巨噬细胞可调节β细胞复制增殖。为了验证这些假设并分析高脂饮食诱导的β细胞复制的机制,我们利用成年C57BL/6J小鼠在给予或不给予含氯膦酸二钠脂质体(一种巨噬细胞耗竭剂)的情况下被喂食高脂饮食7天,建立了短期高脂饮食模型,分别测定建模前与建模完成之后的小鼠体重,测定成模后附睾脂肪垫重量,检测对比非空腹血糖,利用Elisa技术测定空腹血清胰岛素水平,并利用免疫荧光病理技术检测胰岛细胞复制、氧化应激和巨噬细胞的浸润情况。探讨短期高脂饮食与巨噬细胞浸润,胰岛β细胞的复制增殖的关系及其与胰岛素抵抗的相关性,进而阐明高脂饮食下的胰岛β细胞的复制增殖是可动态调节的,分析高脂饮食所诱导的胰岛微观及宏观环境的变化中,炎症反应在β细胞复制中的潜在作用,也有助于提高我们对于肥胖和2型糖尿病患者的功能性β细胞的保护能力。实验结果如下:1.短期高脂饮食(7天)后,与对照组相比,高脂饮食实验组小鼠胰岛内出现明显巨噬细胞浸润及β细胞复制。2.在给予高脂饮食的同时给予氯膦酸二钠脂质体-巨噬细胞清除剂的小鼠,胰岛内巨噬细胞与正常饮食组相比未见明显增加,同时β细胞复制较未使用巨噬细胞耗竭剂的高脂饮食组小鼠相比明显下降,与对照组差异不明显。3.与对照组相比,小鼠空腹血清胰岛素水平在单纯高脂饮食组与高脂饮食同时给予巨噬细胞清除剂组明显升高,说明小鼠胰岛素敏感性下降,高脂饮食同时给予吡格列酮-胰岛素增敏剂组,小鼠空腹血清胰岛素水平略升高,但与对照组相比无明显差异。4.短期高脂饮食后,小鼠的体重,附睾脂肪垫重量以及血糖水平较实验前明显升高。高脂饮食同时给予吡格列酮组小鼠的体重以及血糖水平都未见明显升高,高脂饮食同时给予氯膦酸二钠脂质体组的小鼠血糖水平明也有明显的增高,但体重较造模前未见明显变化。5.对照组与高脂饮食组的8-oxo-2’-deoxyguanosine和活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(activated caspase-3)染色未见明显差异,说明短期高脂饮食并没有显著的诱导DNA损伤或者细胞凋亡。6.基质细胞生成因子(Stromal cell-Derived Factor,SDF)-1在高脂饮食组小鼠胰腺组织的表达情况与正常饮食组小鼠相比,其差异并不明显。7.高脂饮食组发生巨噬细胞浸润后,诱导型一氧化氮合酶(iNOS)阳性的巨噬细胞,即M1型巨噬细胞所占比例明显增加。结合以上实验结果,我们可以得出结论,短期高脂饮食可促进机体及附睾脂肪垫重量和血糖水平的增加,同时也可升高空腹血清胰岛素浓度。喂食高脂饮食的小鼠胰岛β细胞复制、胰岛巨噬细胞浸润显著增加,且iNos阳性的巨噬细胞百分比也有明显升高。同时,短期高脂饮食对DNA损伤及细胞凋亡的诱导作用并不显著。虽然通过巨噬细胞清除剂的治疗,巨噬细胞被清除进而消除了高脂饮食对一道β细胞复制的诱导作用,但不论是否使用巨噬细胞清除剂,高脂饮食后都有明显非空腹血糖和空腹血清胰岛素的水平的持续升高。这些结果表明,高脂饮食诱导巨噬细胞浸润是导致β细胞复制的诱因,且其诱导的β细胞复制的机制与胰岛素抵抗无关。另外我们利用细胞分选技术分选人胰岛细胞,分别获得纯度高于95%的β细胞群与α细胞群,并将其在37度孵育箱中培养3天后,测定α细胞在存在与不存在β细胞及胰岛素时,对不同葡萄糖浓度的应答情况,以探究β细胞对α细胞的功能调节作用。其结果如下:1.当葡萄糖浓度较低时(2mM),单纯α细胞群、α与β混合细胞群都可分泌较高的胰高血糖素,两者之间差异不明显。2.当葡萄糖浓度较高时(16.8mM),其对α与β混合细胞群胰高血糖素释放的抑制作用要明显高于单纯α细胞群。3.高葡萄糖浓度并加入胰岛素后,其对单纯α细胞群释放胰高血糖素的抑制作用明显增强。通过以上研究,我们确立了人胰岛α细胞的体外研究模型,为α细胞的进一步研究提供了一定的基础与新思路。同时我们通过加入β细胞和胰岛素到α细胞群,测定其对葡萄糖浓度的应答情况,再次确定了β细胞对α细胞释放胰高血糖素的调节情况,为下一步对其相关机制的研究提供科学依据。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.1
【图文】：

小鼠,巨噬细胞,免疫荧光染色,β细胞

吉林大学博士学位论文胞，进行免疫荧光染色，查看 F4/80 阳性细胞的表达情况，比较对照组与各实验组之间的巨噬细胞浸润情况的差异。在短期高脂饮食 7 天后，与正常饮食对照组相比，单纯高脂饮食组小鼠胰岛靶向性巨噬细胞数量显著增加(P＜0.05)，其巨噬细胞与胰岛 β 细胞的百分比为 10.74±0.95%，而正常饮食对照组的百分比为 5.32±0.94%(图 4.4, A、B、E)。而由于胰腺外分泌组织中未见明显巨噬细胞浸润，所以我们认为短期高脂饮食诱导的巨噬细胞浸润是胰岛靶向性的。而短期高脂饮食伴巨噬细胞清除剂组的小鼠，其胰岛内未见巨噬细胞增多(图 4.4,C、E)，说明药物起效明显，起到清除巨噬细胞的作用。另外，短期高脂饮食伴吡格列酮(胰岛素增敏剂)组的小鼠胰岛内也未见明显巨噬细胞浸润(图 4.4,D、E)，可能与吡格列酮对巨噬细胞的直接抑制作用有关[80,81]。

胰岛,巨噬细胞,实验动物,百分比

图 4.4 E 巨噬细胞在胰岛内的平均百分比每组实验动物 5 只。与对照组相比，单纯高脂饮食组的小鼠胰岛内巨噬细胞明显增多，*P<0.05，差异有统计学意义。其他两组与对照组相比，无明显差异。Normal Chow: 正常饮食组， HFD: 高脂饮食组， HFD+Clodronate: 高脂饮食伴巨噬细胞清除剂组，HFD+Pioglitazone：高脂饮食伴吡格列酮组。4.2.2 浸润巨噬细胞多为 M1 型巨噬细胞我们知道巨噬细胞具有极强的可塑性，以响应各种环境刺激，这就允许他们具有特异性和显示极化的功能特性，如炎症或抗炎作用。因此，虽然通过上述实验结果，我们已可以确定在高脂饮食早期，已经存在巨噬细胞浸润小鼠胰岛的情况，但是，并不能确定其表型，为进一步研究小鼠胰岛内浸润巨噬细胞的种类，进而更好的理解其在高脂饮食早期在小鼠胰岛内的作用(例如诱导胰岛β 细胞复制)，我们首先检测了实验结束后收集的小鼠胰腺组织所做冰冻切片上M1 型巨噬细胞标记物 iNOS 在 F4/80 阳性细胞上的表达。如图 4.5 所示，正常

切片染色,巨噬细胞,β细胞,免疫荧光染色

图 4.5 巨噬细胞、iNOS 及 β 细胞免疫荧光染食组小鼠胰腺组织切片染色。 E-H：单纯高脂饮食用抗胰岛素抗体(紫色)进行免疫染色。B 和 F：巨噬化染色。C 和 G：iNOS 用抗 iNOS 抗体(绿色)和 F4／和 H：iNOS 和胰岛素染色的叠加。细胞核染色为蓝色看到两个巨噬细胞，其中一个为 iNOS 阳性，另一个为处可以看到一个 iNOS 阳性巨噬细胞。

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