二氢杨梅素对大鼠海马P2X7受体介导的糖尿病神经病理痛合并抑郁症的作用研究

发布时间：2020-08-21 01:03

【摘要】：研究背景和目的:糖尿病神经病理痛(diabetic neuropathic pain,DNP)是糖尿病的常见并发症之一,伴有自发性疼痛、知觉过敏和植物神经功能障碍,通常表现为肢体远端特别是下肢皮肤烧灼样疼痛,严重的还可导致焦虑或抑郁样行为。糖尿病有时会引起抑郁症等大脑认知功能障碍,另一方面抑郁(depression,DP)也是导致糖尿病神经病理痛发展的一个危险因素。当DNP和DP共同发病时,会对患者的生活质量产生极大的影响。P2X_7受体是ATP门控离子通道家族中的一员,研究表明其可能参与了痛觉信息的调制和传导以及抑郁症的发病。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在神经系统发育中可促进神经元的生长、分化并维持神经元的存活,在海马、基底核及前脑活跃表达,并已证实与抑郁密切相关。二氢杨梅素(Dihydromyricetin,DHM)可降低糖尿病大鼠血糖血脂,减弱神经损害作用。本课题通过建立糖尿病神经病理性疼痛合并抑郁症模型,研究二氢杨梅素对糖尿病神经病理痛合并抑郁症大鼠海马P2X_7受体和BDNF的影响及其机制,为临床治疗糖尿病神经病理痛合并抑郁症提供新的实验依据。方法:将实验大鼠随机分为:正常对照组(Control组)、正常+二氢杨梅素组(Control+DHM组)、模型+生理盐水组(DNP+DP组)、模型+二氢杨梅素组(DNP+DP+DHM组)、模型+P2X_7拮抗剂A438079(DNP+DP+A438079)组。建立糖尿病神经病理痛合并抑郁症模型,通过足底机械痛阈值(MWT)、热痛敏阈值(TWL)、糖水偏好实验(SPT)、强迫游泳不动时间(IMFST)、旷场实验(OFT)观察大鼠行为变化。通过QPCR和蛋白印迹来检测各组大鼠海马中P2X_7、BDNF、TrkB的表达。采用免疫组化方法观察海马中P2X_7和BDNF的表达,并通过免疫荧光双标的方法来检测海马中嘌呤受体P2X_7与GFAP(胶质细胞标记物)共表达的情况。采用ELISA检测各组大鼠血清炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的变化情况。采用蛋白印迹实验检测大鼠海马中ERK1/2及其磷酸化程度的变化。结果:1、造模成功后,模型组大鼠的MWT、TWL、SPT和OFT值与Control组相比显著性降低,IMFST显著升高(p0.01),给予二氢杨梅素和拮抗剂处理后,DNP+DP+DHM组和DNP+DP+A438079的MWT、TWL、SPT和OFT值较DNP+DP组明显升高,IMFST显著降低(p0.01),而Control组与Control+DHM组相比其差异无统计学意义(p0.05)。2、QPCR结果表明,DNP+DP组海马P2X_7受体表达较Control组明显升高(p0.01),BDNF、TrkB的表达明显下降(p0.05);二氢杨梅素和拮抗剂处理后,DNP+DP+DHM组和DNP+DP+A438079组海马P2X_7受体较DNP+DP组明显降低(p0.01),BDNF、TrkB的表达明显升高(P0.05);而Control组与Control+DHM组相比其差异无统计学意义(p0.05)。3、蛋白印迹结果表明,各组总TrkB表达无统计学意义(p0.05),与Control组比较,DNP+DP组中P2X_7的表达水平显著升高(P0.01),BDNF蛋白和p-TrkB蛋白的表达明显下降(P0.05);DNP+DP+DHM组和DNP+DP+A438079组海马P2X_7的表达较DNP+DP组明显降低(p0.05),BDNF蛋白和p-TrkB蛋白的表达明显升高(P0.05);而Control组与Control+DHM组相比其差异无统计学意义(p0.05)。4、免疫组化结果显示,DNP+DP组海马P2X_7受体的表达较Control组明显升高(p0.01),DNP+DP+DHM组和DNP+DP+A438079组较DNP+DP组明显降低(p0.01);DNP+DP组海马BDNF的表达较Control组明显下降(p0.05),DNP+DP+DHM组和DNP+DP+A438079组较DNP+DP组明显升高(p0.05);而Control组与Control+DHM组相比其差异无统计学意义(p0.05)。5、免疫荧光双标结果表明,DNP+DP组大鼠海马胶质细胞P2X_7受体和GFAP的共表达增高,二氢杨梅素和A438079能对此起到抑制作用。6、ELISA检测结果表明,DNP+DP组血清TNF-α和IL-1β水平较Control组明显升高(p0.01),DNP+DP+DHM组和DNP+DP+A438079组较DNP+DP组明显下降(p0.01),而Control组与Control+DHM组相比其差异无统计学意义(p0.05)。7、采用蛋白印迹方法测量海马中ERK1/2磷酸化程度,结果表明:各实验组中ERK1/2对β-actin的积分光密度比值无统计学意义(p0.05),与Control组比较,DNP+DP组中p-ERK1/2对ERK1/2的积分光密度比值显著升高,ERK1/2磷酸化程度明显增强(P0.01);DNP+DP+DHM组和DNP+DP+A438079组ERK1/2磷酸化水平较DNP+DP组明显降低(P0.01)。结论:二氢杨梅素可以抑制糖尿病神经病理痛合并抑郁症大鼠的疼痛和抑郁样行为,与P2X_7拮抗剂A438079的效果相一致,其机制可能与降低海马的P2X_7表达,促进海马BDNF的表达上调,导致TNF-α和IL-1β的水平下降以及海马ERK1/2磷酸化水平下降有关。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2
【图文】：

2.2.1 动物模型和分组雄性 SD 大鼠，体重 180-220 g，由南昌大学动物科学研究中心提供，合格证号：SYXK(赣)2015-0003。高糖高脂喂养 4 周后，空腹 12 小时以上（禁食不禁水），腹腔注射链脲佐菌素（STZ）（30mg/kg），测其随机血糖≥16.7mmol/L 视为 2 型糖尿病大鼠模型建立成功，连续测 3 周行为学，筛选出有疼痛并发症的大鼠，与此同时给予慢性不可预知性应激刺激（4℃冰水游泳 5min，45℃热水游泳 5min，夹尾 1min，倾笼 12h，昼夜颠倒 24h，禁食禁饮 24h）3 周，每周测糖水偏好试验（SPT），强迫游泳试验不动时间（IMFST）和旷场实验（OFT）筛选出有糖尿病病理痛和抑郁症共病的大鼠。将实验大鼠随机分为：正常对照组(Control 组)、正常+二氢杨梅素组（Control+ DHM 组）、模型 + 生理盐水组 (DNP+DP 组 ) 、模型 + 二氢杨梅素组(DNP+DP+DHM 组)、模型+P2X7拮抗剂 A438079（DNP+DP+A438079）组。建模成功后予 DNP+DP+DHM 组腹腔注射二氢杨梅素 30mg/kg，每 24h 一次，连续 14 天；DNP+DP+A438079 组腹腔注射 A438079 拮抗剂 80umol/kg，每 48h 一次，连续 14 天。

第 3 章实验结果第 3 章 实验结果机械痛敏阈值和热缩足反射潜伏期测定结果雄性成年的 SD 大鼠进行糖尿病合并抑郁症模型的制备，STZ知性应激刺激 3 周后 DNP 合并 DP 建模成功，模型组较 Con和热缩足反射潜伏期显著下降（p<0.01），模型大鼠随机分成+DP+DHM 组、DNP+DP+A438079 组，从第 4 周开始打药+DHM 组和 DNP+DP+A438079 组机械痛敏阈值和热缩足反射 DNP+DP 组相比有显著性差异(p<0.01)，而 Control 组与 Con统计学意义（p>0.05）（Fig 2）。

第 3 章实验结果3.2 大鼠糖水偏嗜度、强迫游泳不动时间和旷场实验测量结果STZ 注射加慢性不可预知性应激刺激 3 周后 DNP 合并 DP 建模成功，慢性不可预知性应激刺激 3 周后 DNP+DP 组、DNP+DP+DHM 组、DNP+DP+A438079组较 Control 组糖水偏嗜度和旷场运动总距离显著下降（p<0.01），强迫游泳不动时间显著升高（p<0.01），从第 4 周开始打药，第 5 周 DNP+DP+DHM 组和DNP+DP+A438079 组糖水偏嗜度和旷场运动总距离明显增加，强迫游泳不动时间明显下降，与 DNP+DP 组相比有显著性差异(p<0.01)，而 Control 组与Control+DHM 组相比无统计学意义（p>0.05）（Fig3）。

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