气道上皮细胞miR-221-3p在哮喘气道嗜酸性粒细胞炎症中的作用和机制

发布时间：2020-08-23 15:27

【摘要】：第一部分哮喘患者气道上皮细胞、诱导痰及血浆miR-221-3p表达水平及与气道嗜酸性粒细胞炎症程度的相关性研究目的:检测哮喘患者及健康受试者气道刷片、诱导痰和血浆中的miR-221-3p的表达情况,探究其与气道嗜酸性粒细胞炎症程度的相关性。并检测吸入激素治疗前后哮喘患者诱导痰中的miR-221-3p表达水平的变化。方法:在77例哮喘患者,36例健康受试者样本中检测气道刷片、诱导痰和血浆中的miR-221-3p,并使用原位杂交方法,在气道上皮细胞中定位miR-221-3p表达位置。并对气道刷片中miR-221-3p的表达情况与诱导痰中的嗜酸性粒细胞比例、单位面积气道活检组织内嗜酸性粒细胞数量、呼出气NO、外周血嗜酸性粒细胞量和血浆总Ig E等炎症指标进行相关性分析。real-time PCR法检测哮喘患者气道刷片中Th2标记基因CLCA1,POSTN及SERPINB2的表达水平,并用three-gene-mean的方法分析其与哮喘患者气道刷片中miR-221-3p的相关性。对于哮喘诊断标准之一的肺功能及激发试验,分析FEV1%、PD20与气道刷片中miR-221-3p的相关性。检测ICS治疗前后诱导痰中miR-221-3p的表达水平变化,分析miR-221-3p的表达水平变化对于哮喘治疗效果的反映。结果:分析纳入受试者的基本资料显示,支气管哮喘组和健康对照组两组在性别和年龄比上均无明显差异。支气管哮喘组诱导痰中的嗜酸性粒细胞比例、单位面积气道活检组织内嗜酸性粒细胞数量、外周血嗜酸性粒细胞量及血浆总Ig E含量均显著高于健康对照组。健康对照组的PD20值FEV1%预计值和支气管激发试验的FEV1%预计值均显著高于支气管哮喘组。原位杂交检测的气道活检标本结果显示,miR-221-3p主要表达在气道上皮细胞的胞浆部位,且哮喘组的miR-221-3p表达显著弱于健康对照组。支气管哮喘组的气道刷片、诱导痰和血浆中的miR-221-3p转录水平显著低于健康对照组。通过相关性分析,我们发现支气管哮喘组气道刷片中miR-221-3p与诱导痰中的嗜酸性粒细胞比例(r=-0.70,p0.001)、单位面积气道活检组织内嗜酸性粒细胞数量(r=-0.61,p0.001)、呼出气NO(r=-0.69,p0.001)、外周血嗜酸性粒细胞量(r=-0.59,p0.001)、血浆总Ig E(r=-0.42,p0.001)和Th2标记基因(r=-0.69,p0.001)呈显著负相关关系,与FEV1%预计值(r=0.40,p=0.02)和支气管激发试验的PD20值(r=0.67,p0.001)呈明显的正相关。诱导痰和外周血中哮喘组miR-221-3p转录水平显著低于健康对照组,且和上述的炎症指标均呈现显著的负相关,和气道刷片中的miR-221-3p呈显著正相关。检测ICS治疗前后诱导痰中miR-221-3p的表达水平变化,在ICS治疗后,下降的miR-221-3p转录水平得到一定程度上的恢复。结论:miR-221-3p在支气管哮喘患者的气道刷片、诱导痰和血浆中显著下降,且主要表达在气道上皮细胞的胞浆部位。支气管哮喘患者气道miR-221-3p转录水平与气道嗜酸性粒细胞炎症程度呈显著负相关。诱导痰和血浆中的miR-221-3p和气道刷片中的miR-221-3p呈显著正相关,并与气道嗜酸性粒细胞炎症程度呈显著负相关。在ICS治疗前后诱导痰miR-221-3p的表达水平产生变化,气道上皮细胞内下降的miR-221-3p转录水平在治疗后得到一定程度上的恢复。第二部分miR-221-3p的靶基因CXCL17通过p38 MAPK信号通路抑制气道上皮细胞炎性细胞因子表达目的:确定miR-221-3p的靶基因为CXCL17,并对其参与哮喘气道炎症的机制开展研究。地塞米松对miR-221-3p和CXCL17的转录水平的影响。方法:使用Th2细胞因子IL-13刺激BEAS-2B细胞。转染miR-221-3p的mimic和inhibitor,检测哮喘气道炎症因子的变化。根据多个生物计算分析软件分析,筛选miR-221-3p的靶基因。采用双荧光实验,验证CXCL17为miR-221-3p的靶基因。使用real-time PCR法和免疫组化检测CXCL17在气道上皮中的表达情况及部位,分析其与气道刷片标本中miR-221-3p表达的相关性。real-time PCR法检测CXCL17在使用地塞米松后的变化,real-time PCR法和ELISA法检测使用p38 MAPK抑制剂SB203580、转染CXCL17si RNA和CXCL17高表达质粒后,CCL24、CCL26、POSTN的转录水平和蛋白表达水平表达变化。结果:IL-13刺激BEAS-2B细胞,在转录水平上,细胞中的miR-221-3p下降,于此同时炎性因子CCL24、CCL26、POSTN表达增加。转染miR-221-3p inhibitor使CCL24、CCL26、POSTN在转录水平和蛋白水平均下降。转染miR-221-3p mimic使CCL24、CCL26、POSTN的转录水平和蛋白水平均升高。地塞米松使IL-13刺激引起的miR-221-3p的下降得到恢复,炎性因子的上升得到缓解。通过双荧光实验,证明CXCL17是miR-221-3p的靶基因,两者之间通过碱基反向互补配对发生结合作用。通过real-time PCR检测和免疫组化检测,CXCL17在哮喘组的气道上皮中位于胞浆的位置同时表达增加,且与气道刷片标本中miR-221-3p表达呈显著的负相关。地塞米松使IL-13刺激引起的CXCL17的升高得到恢复。转染CXCL17si RNA和CXCL17高表达质粒,使用p38 MAPK抑制剂SB 203580,CCL24、CCL26、POSTN的转录水平和蛋白表达水平产生了显著变化,证明CXCL17通过p38 MAPK通路调控IL-13刺激后CCL24、CCL26、POSTN的表达。结论:miR-221-3p在气道上皮细胞炎性细胞因子CCL24、CCL26、POSTN的表达中有重要的调节作用。CXCL17为miR-221-3p的靶基因,地塞米松使IL-13刺激引起的miR-221-3p的下降得到恢复,使IL-13刺激引起的CXCL17的升高得到缓解。CXCL17在哮喘组的气道上皮中位于胞浆的位置并表达增加,且与气道刷片标本中miR-221-3p表达呈显著的负相关。CXCL17通过p38 MAPK信号通路调控IL-13刺激后CCL24、CCL26、POSTN的表达。第三部分气道高表达miR-221-3p加重小鼠HDM哮喘模型的气道炎症及粘液分泌目的:探究miR-221-3p在HDM所致的小鼠哮喘模型中的表达情况,探讨其在气道炎症及粘液分泌中的作用。方法:使用HDM构建小鼠哮喘模型,并用real-time PCR法检测小鼠肺组织中miR-221-3p、炎性因子Il-4、Il-5、Il-13、Ccl24、Ccl26和Postn的表达情况。根据小鼠肺组织石蜡切片的HE染色显示的气道周围炎症细胞,对浸润程度进行评分。对肺泡灌洗液(BALF)中的细胞总数及巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞进行计数。ELISA法检测小鼠血浆中总Ig E的含量,以及BALF中炎性因子Il-4、Il-5、Il-13、Ccl24和Postn的蛋白表达变化。此外,real-time PCR法检测小鼠肺组织中粘液表达基因Muc5ac和Muc5b的转录水平和糖原染色(PAS)评价气道粘液表达。结果:在小鼠HDM哮喘模型中,肺组织气道上皮细胞胞浆中的miR-221-3p表达下降。气道高表达miR-221-3p使小鼠的气道炎症加重,嗜酸性粒细胞等炎症细胞在气道周围的浸润增多,也使小鼠BALF细胞总数、巨噬细胞,特别是嗜酸性粒细胞增多。小鼠肺组织中炎性因子Il-4、Il-5、Il-13、Ccl24、Ccl26和Postn和静脉血浆中的总Ig E在气道高表达miR-221-3p后升高。此外,小鼠气道粘液分泌也在气道高表达miR-221-3p后增多。结论:在小鼠HDM哮喘模型中,肺组织中的miR-221-3p表达下降。气道高表达miR-221-3p使小鼠的气道炎症加重,气道粘液分泌增多。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R562.25
【图文】：

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文2、气道刷片和活检标本中 miR-221-3p 的表达情况为了检测气道刷片和活检标本中 miR-221-3p 的表达情况，我们将气道刷片标本提取 RNA，使用 real-time PCR 法进行检测，我们发现，支气管哮喘组气道刷片标本中miR-221-3p 表达量明显低于健康对照组（p<0.001）（图 1A）。与此同时，将气道活检标本石蜡包埋后切片，并采用原位杂交的手段，检测在气道上皮细胞中 miR-221-3p的表达位置和定量。我们发现 miR-221-3p 主要在胞浆表达，在支气管哮喘组中表达显著低于健康对照组（图 1B）。这说明支气管哮喘组 miR-221-3p 在气道刷片和活检标本中的表达下降，且主要表达在气道上皮细胞的胞浆处。

嗜酸性粒细胞是反映过敏性炎症的主要炎症细胞，哮喘的气道嗜酸性粒细胞炎症的情况，可以使用诱导痰中的嗜酸性粒细胞比例、单位面积气道活检组织内嗜酸性粒细胞数量和呼出气 NO 评估。为了评估气道刷片标本中 miR-221-3p 的表达情况及气道嗜酸性粒细胞炎症指标的相关性，我们将纳入受试者的气道刷片标本中 miR-221-3p的表达量和诱导痰中的嗜酸性粒细胞比例、单位面积气道活检组织内嗜酸性粒细胞数量和呼出气 NO 进行相关性分析。发现 miR-221-3p 的表达量和反应气道嗜酸性粒细胞炎症的指标存在相关性，且呈显著的负相关。特别是在支气管哮喘组中，诱导痰中的嗜酸性粒细胞比例（r=-0.70，p<0.001）（图 2A）、单位面积气道活检组织内嗜酸性粒细胞数量（r=-0.61，p<0.001）（图 2B）和呼出气 NO（r=-0.69，p<0.001）（图 2C）与 miR-221-3p 的表达量的负相关尤其显著。结果提示我们，气道刷片标本中miR-221-3p 的表达情况与气道嗜酸性粒细胞炎症指标之间存在负相关，气道刷片标本中 miR-221-3p 的表达情况可以在一定程度上反映患者气道嗜酸性粒细胞炎症。

积气道活检组织内嗜酸性粒细胞数量，健康对照组（n＝21）。采用 Spearman 等级相关进行相关性分析。4、气道刷片标本中 miR-221-3p 的表达情况与外周血中过敏性炎症指标的相关性在外周血中，通常检测外周血嗜酸性粒细胞量和血浆总IgE用来反映过敏性炎症。为了评估气道刷片标本中 miR-221-3p 的表达情况及外周血中过敏性炎症指标的相关性，将纳入受试者的气道刷片标本中 miR-221-3p 的表达量和外周血嗜酸性粒细胞量和血浆总 IgE 进行相关性分析。发现 miR-221-3p 的表达量与外周血嗜酸性粒细胞量（r=-0.59，p<0.001）（图 3A）和血浆总 IgE（r=-0.42，p<0.001）（图 3B）等过敏性炎症的指标存在相关性，且呈显著的负相关。结果提示我们，气道刷片标本中 miR-221-3p的表达情况与外周血中过敏性炎症指标之间存在负相关，气道刷片标本中 miR-221-3p的表达情况可以在一定程度上反映患者过敏性炎症。

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