FTY720对晚期糖基化终产物诱导血管内皮细胞损伤影响的研究

发布时间：2020-09-10 19:38

　　 目前全球糖尿病发病率和患病逐年升高,糖尿病并发症严重影响糖尿病患者的健康水平,其中糖尿病血管并发生症已成为导致糖尿病患者致残、致死的主要原因。其中,晚期糖基化终产物(AGEs)在糖尿病血管病变发生和发展中的作用备受关注。晚期糖基化终产物可激活细胞内信号通路,引起下游炎症因子释放,造成血管内皮细胞损伤,但具体信号通路仍有待研究证实。有研究显示,FTY720(芬戈莫德)可能在糖尿病血管病变治疗中具有重要意义。目前在体动物实验证实FTY720可与血管内皮细胞上的1-磷酸鞘氨醇受体1和3相结合,影响下游信号分子的合成和释放,从而改善内皮细胞功能,保护血管内皮细胞。但是FTY720对晚期糖基化终产物诱导血管内皮细胞损伤的作用及具体作用机制尚不十分清楚。目的:探究FTY720对晚期糖基化终产物诱导血管内皮细胞损伤中的作用及可能的作用信号通路。方法:体外培养EA.hy926细胞株,实验分为对照组、AGEs损伤组、FTY720+AGEs组。FTY720+AGEs组用浓度为7.5umol/L的FTY720处理6小时,对照组和AGEs损伤组不加任何试剂同步处置相同时间后,AGEs损伤组、FTY720+AGEs组均加入AGEs(终浓度为200mg/L)诱导细胞损伤,12小时后显微镜线观察细胞形态,用CCK-8法检测各组细胞活力。采用Griess法检培养液上清中NO含量,Elisa试剂盒检测细胞匀浆中IL-6、IL-1β的浓度。Western blot法检测细胞匀浆中PI3K磷酸化水平。结果:AO/EB染色显示,荧光显维镜下观察到,对照物细胞染色质呈绿色且结构正常,细胞形态呈正常的多角形或梭形,AGEs损伤组,部分细胞染色质呈橘红色、核固缩,细胞肿胀扁圆。FTY720+AGEs组细胞核染色质着绿色呈固缩状,细胞触角消失,略变圆。CCK-8法检测结果显示,与对照组相比,AGEs损伤组和FTY720+AGEs组细胞活力下降(P0.05),与AGEs损伤组相比,FTY720+AGEs组细胞活力升高(P0.05)。Griess、Elisa和Western blot结果显示,与对照组相比,AGEs损伤组和FTY720+AGEs组NO、IL-6、IL-1β浓度、PI3K磷酸化水平升高(P0.05)。与AGEs损伤组相比,FTY720+AGEs组NO、IL-6、IL-1β浓度、PI3K磷酸化水平减低(P0.05)。结论:1、AGEs可通过增强PI3K磷酸化,引起NO、IL-6、IL-1β等物质释放,导致内皮细胞损伤。2、FTY720可抑制PI3K磷酸化,减少NO、IL-6、IL-1β等物质释放,从而减轻AGEs引起的内皮细胞损伤。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2
【部分图文】：

图 3.1 各实验组 AO/EB 染色结果（各图片分辨率均为 200）凋亡细胞：荧光显微镜下核染色质呈橘红色，细胞肿胀变圆。介于正常和凋亡细胞间细胞。正常细胞：荧光显微镜下核染色质为绿色，细胞成梭形或多触角

83.2 CCK-8 法测定细胞活力图3.3 细胞活力测定（ X ±S，n=6）* 代表与对照组相比，P<0.05； # 代表与AGEs损伤组相比，P<0.05。与对照组相比，AGEs损伤组和FTY720+AGEs组细胞活力减低，P<0.05；与AGEs损伤组相比，FTY720+AGEs组细胞活力升高，P<0.05。

中国医科大学硕士学位论文3.3 Griess 法检测 NO 含量，Elisa 法测量 IL-6、IL-1β的含量依据所用Griess试剂盒使用说明，将待测样品、标准品在540nm的OD值和标准品浓度代入公式：（待测定OD值-空白OD值）/（标准品OD值-空白OD值）×标准品浓度(20umol/L)÷待测样品蛋白质浓度(g/L)，计算得出实际样品浓度（单位：umol/g）。依据所用IL-6、IL-1β Elisa试剂盒使用说明，用标准物的浓度和450nm的OD值计算出标准曲线的回归方程，将待测样品在450nm的OD值带入回归方程，计算出的样品浓度需再乘以稀释倍数（本样品稀释10倍），即为实际样品浓度。3.3.1 NO

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