SerpinB1在猪胰腺干细胞增殖及向胰岛素分泌细胞分化中的作用及机理
发布时间：2020-09-18 18:51
糖尿病是一种代谢类疾病,又称高血糖症,表现为多食、多尿、多饮、体重减少。长期的高血糖引起机体多个组织器官的损伤,尤其是眼、肾、心脏、血管和神经等的功能障碍。胰岛β细胞损伤是糖尿病的症结所在。猪的胰腺干细胞(Pocine Pancretic Stem Cells,pPSCs)是从胎猪胰腺中分离出来的一种成体干细胞,在细胞中转入大T载体形成永生化细胞系,实验室先前的研究证明该细胞经化学小分子诱导可分化为胰岛素分泌细胞。又因猪的基因组以及胰岛素的结构与人的相似性,所以研究pPSCs对未来糖尿病的临床治疗具有深远的意义。SerpinB1是一种蛋白酶抑制剂,通过抑制蛋白酶活性缓解由炎性反应所引起的组织损伤。有研究表明,肝的胰岛素抵抗促进了SerpinB1的分泌,作用于胰腺促进胰岛β细胞的增殖,并且这一反应与其蛋白酶抑制剂活性相关。干细胞的自我更新和分化受到机体内多种细胞因子的调控,胰腺干细胞作为一种成体干细胞,SerpinB1对成体干细胞-猪胰腺干细胞的影响目前仍不清楚。本实验探究了SerpinB1对pPSCs中影响及作用机理。通过超表达和干扰pPSCs中SerpinB1的表达,一方面证实超表达SerpinB1可以促进pPSCs的增殖,另一方面发现SerpinB1在pPSCs诱导分化后期表达量增加,干扰SerpinB1影响了pPSCs的诱导分化效率,不利于胰岛素分泌细胞的形成。本实验为pPSCs的增殖机制提供了理论依据,另外为体外高效的获得胰岛素分泌细胞提供了新的思路和手段。1.SerpinB1促进pPSCs的增殖首先,通过运用qRT-PCR(实时荧光定量)对pPSCs中的SerpinB1的mRNA水平进行检测发现,SerpinB1在pPSCs中大量表达。随后一方面运用shRNA干扰SerpinB1在细胞中的表达,另一方面使细胞超表达SerpinB1。通过CCK-8检测发现干扰SerpinB1使细胞的活性降低,超表达SerpinB1增强了细胞活性。随后的EdU、流式细胞术周期检测以及qRT-PCR结果显示,与正常的细胞相比,干扰SerpinB1后细胞的EdU阳性率明显降低,处于S期的细胞比率下降,并且细胞中CDK2、PCNA以及CyclinD1的mRNA表达水平显著降低,说明SerpinB1促进pPSCs进入S期而促进pPSCs的增殖。Western blotting检测蛋白水平结果显示,超表达SerpinB1激活了STAT3、CDK2、和CyclinD1蛋白水平的表达,抑制了P53和P21的表达。所以我们推测SerpinB1通过STAT3信号通路促进pPSCs的增殖。2.SerpinB1促进pPSCs诱导分化成胰岛素分泌细胞首先,我们运用两步诱导法诱导pPSCs形成胰岛素分泌细胞,qRT-PCR和Western blotting的检测结果显示胰岛素分泌细胞中SerpinB1的表达水平显著升高。随后分别在诱导1d、3d、9d取样进行Western blotting检测发现,SerpinB1在整个诱导过程中的表达逐渐升高。其后,分别对干扰和超表达SerpinB1的pPSCs进行诱导,与对照组相比,发现干扰SerpinB1的表达后,诱导形成的胰岛素分泌细胞在悬浮诱导培养基中聚团松散不致密,培养基中存在大量悬浮的零散细胞,聚团后的细胞不易贴壁,细胞迁出率低,DTZ和Insulin染色显色不明显,在mRNA水平低表达Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA,并且ELISA检测发现,高糖刺激反应不灵敏。超表达SerpinB1后,在mRNA水平,Insulin、NeuroD、PDX1、Glut-2、Nkx6.1和MafA的表达明显升高,胰岛素分泌量显著性的增加。据此我们推测,SerpinB1影响了pPSCs向胰岛素分泌细胞的诱导效率。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：
图 1-1 1 型糖尿病的发病过程(Katsarou et al. 2017)Fig 1-1 Staging of Type 1 Diabetes(Katsarou et al. 2017)2 型糖尿病又称“非胰岛素依赖型糖尿病”或“成人型糖尿病”，占糖尿病患病总0%-95%。2 型糖尿病的发生常与肥胖有关，有研究表明，肥胖会引起肝脏或者胰岛素耐受，长期的胰岛素耐受以及后期的胰岛素分泌不足将导致机体代谢紊血液中的葡萄糖和脂质的含量增加 (Jensen et al. 2013)。胰岛素耐受是由多种因，诱因包括：脂质等代谢燃料的过量积累、炎性反应以及内质网应激 (Ferrannini et al. 2013)。胰岛素耐受主要发生在肝脏、骨骼肌和脂肪细胞 3 个部位。在肝脏的脂肪酸或者葡萄糖使脂肪酸的代谢脱离线粒体的氧化途径，转而进行酯化途大量的脂质，进而激活丝氨酸激酶，磷酸化胰岛素受体，使胰岛素信号转导分最后肝脏产生胰岛素耐受。而在骨骼肌细胞中，过量的脂肪酸造成脂肪酸的非，未完全氧化的脂质积累在线粒体内，产生大量的自由基，进而引发肌细胞的，激活丝氨酸激酶阻碍胰岛素信号的传导而引起骨骼肌的胰岛素耐受 (Jensen )。2 型糖尿病另外一个病理特征是 β 细胞的损伤，过多的营养摄入需要胰岛合胰岛素，大量的胰岛素合成增加了 β 细胞内质网的负担，引发的内质网应激使
受到胰腺或者胰岛供体不足以及长期使用免疫抑制剂的限制 (Shapiro et al. 2016)。来，细胞疗法成为治疗糖尿病的一种新方法，通过促进 β 细胞的再生而获得功能成β 细胞已经成为国内外的研究热点。1.2.2 获得功能 β 胞的方法1.2.2.1 诱导干细胞分化成 β 样细胞由于干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，诱导胚胎干细胞（ESCs）或者成细胞分化、获得功能成熟的 β 细胞成为体外获得大量 β 细胞的方法，打破了 β 细胞供体不足对糖尿病临床治疗的限制。我们知道，胰腺是由内胚层发育而来的，在胚育过程中，ESCs 在 TGF-β、activin、Wnt 和(PI(3)K)-AKT 等信号通路的作用下，定化成内胚层 (D'Amour et al. 2005; D'Amour et al. 2006; Kubo et al. 2004; Mclean e2007; Stainier 2002)。随后在维甲酸、BMP（骨形态发生蛋白）以及 Hedgehog 的作用发育成 PDX1+胰腺祖细胞 (Diiorio et al. 2002; Roy et al. 2001; Stafford and Prince 2Tiso et al. 2002)。随后 FGF10 激活 Notch 信号通路调控胰腺祖细胞向胰腺导管细胞分泌细胞和外分泌细胞发育 (Bhushan et al. 2001; Hart et al. 2003)。
图 1-3 促进 β 细胞增殖的细胞因子(Tarasov and Rorsma 1-3 β-Cell Proliferation Is Stimulated by Circulating Factors(T1 与 STAT3 信号通路1 概述1 是丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpins）超家族的一员。上，Serpins 是由单体蛋白组成的超家族，大小范分支，每个分支包含 3-77个成员 (Silverman et al., 2一员，被称为单核-嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，抑制多种蛋白酶的活性，如嗜中性弹性蛋白酶，a et al. 2002; Cooley et al. 2001)。1 的研究进展1 通过抑制蛋白酶的活性来调控炎症反应 (Silverm SerpinB1 与免疫性疾病、癌症以及糖尿病发生的
本文编号：2822036
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：
图 1-1 1 型糖尿病的发病过程(Katsarou et al. 2017)Fig 1-1 Staging of Type 1 Diabetes(Katsarou et al. 2017)2 型糖尿病又称“非胰岛素依赖型糖尿病”或“成人型糖尿病”，占糖尿病患病总0%-95%。2 型糖尿病的发生常与肥胖有关，有研究表明，肥胖会引起肝脏或者胰岛素耐受，长期的胰岛素耐受以及后期的胰岛素分泌不足将导致机体代谢紊血液中的葡萄糖和脂质的含量增加 (Jensen et al. 2013)。胰岛素耐受是由多种因，诱因包括：脂质等代谢燃料的过量积累、炎性反应以及内质网应激 (Ferrannini et al. 2013)。胰岛素耐受主要发生在肝脏、骨骼肌和脂肪细胞 3 个部位。在肝脏的脂肪酸或者葡萄糖使脂肪酸的代谢脱离线粒体的氧化途径，转而进行酯化途大量的脂质，进而激活丝氨酸激酶，磷酸化胰岛素受体，使胰岛素信号转导分最后肝脏产生胰岛素耐受。而在骨骼肌细胞中，过量的脂肪酸造成脂肪酸的非，未完全氧化的脂质积累在线粒体内，产生大量的自由基，进而引发肌细胞的，激活丝氨酸激酶阻碍胰岛素信号的传导而引起骨骼肌的胰岛素耐受 (Jensen )。2 型糖尿病另外一个病理特征是 β 细胞的损伤，过多的营养摄入需要胰岛合胰岛素，大量的胰岛素合成增加了 β 细胞内质网的负担，引发的内质网应激使
受到胰腺或者胰岛供体不足以及长期使用免疫抑制剂的限制 (Shapiro et al. 2016)。来，细胞疗法成为治疗糖尿病的一种新方法，通过促进 β 细胞的再生而获得功能成β 细胞已经成为国内外的研究热点。1.2.2 获得功能 β 胞的方法1.2.2.1 诱导干细胞分化成 β 样细胞由于干细胞具有自我更新和多向分化的潜能，诱导胚胎干细胞（ESCs）或者成细胞分化、获得功能成熟的 β 细胞成为体外获得大量 β 细胞的方法，打破了 β 细胞供体不足对糖尿病临床治疗的限制。我们知道，胰腺是由内胚层发育而来的，在胚育过程中，ESCs 在 TGF-β、activin、Wnt 和(PI(3)K)-AKT 等信号通路的作用下，定化成内胚层 (D'Amour et al. 2005; D'Amour et al. 2006; Kubo et al. 2004; Mclean e2007; Stainier 2002)。随后在维甲酸、BMP（骨形态发生蛋白）以及 Hedgehog 的作用发育成 PDX1+胰腺祖细胞 (Diiorio et al. 2002; Roy et al. 2001; Stafford and Prince 2Tiso et al. 2002)。随后 FGF10 激活 Notch 信号通路调控胰腺祖细胞向胰腺导管细胞分泌细胞和外分泌细胞发育 (Bhushan et al. 2001; Hart et al. 2003)。
图 1-3 促进 β 细胞增殖的细胞因子(Tarasov and Rorsma 1-3 β-Cell Proliferation Is Stimulated by Circulating Factors(T1 与 STAT3 信号通路1 概述1 是丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serpins）超家族的一员。上，Serpins 是由单体蛋白组成的超家族，大小范分支，每个分支包含 3-77个成员 (Silverman et al., 2一员，被称为单核-嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，抑制多种蛋白酶的活性，如嗜中性弹性蛋白酶，a et al. 2002; Cooley et al. 2001)。1 的研究进展1 通过抑制蛋白酶的活性来调控炎症反应 (Silverm SerpinB1 与免疫性疾病、癌症以及糖尿病发生的
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 楚元奎;曹晖;王峗;张翊华;窦忠英;;胎猪胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及其移植治疗裸鼠糖尿病的研究[J];农业生物技术学报;2011年01期
2 蒋泽生;高毅;慕宁;;共培养诱导人骨髓多能成体祖细胞分化为肝细胞样细胞[J];中华医学杂志;2007年06期
相关博士学位论文 前1条
1 楚元奎;胎猪胰岛间充质干细胞分离鉴定及向胰岛素分泌细胞分化的研究[D];西北农林科技大学;2011年
本文编号：2822036
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