NF-κB信号通路介导下自噬参与高脂饮食大鼠颌骨代谢机制的研究

发布时间：2020-10-31 11:43

　　 目的:高脂血症又称脂质代谢异常或紊乱,可分为高胆固醇血症、高甘油三酯血症、混合型高脂血症,是糖尿病、动脉粥样硬化、心血管疾病、骨质疏松症等疾病的主要诱发因素之一,临床发病率高,严重危害人们的身体健康。作为高脂血症相关的骨代谢性疾病,骨质疏松症是一种以骨量减少,骨微结构破坏为特征的全身性骨骼疾病,常引起骨的脆性增加,容易发生骨折。口腔骨是全身骨骼的一部分,骨密度减低可能导致颌骨结构减弱,影响义齿修复的效果,不利于种植体的骨整合。口腔骨丢失与骨质疏松症具有一定的相关性,是近年来学者研究的热点之一。众多研究认为在颌骨组织中高脂血症与骨密度呈反向相关,低骨密度将影响种植牙的骨整合、初期稳定性及功能。然而,有学者发现含有甘油三脂的高脂饮食喂养的大鼠不会导致骨量丢失,反而有利于骨的功能结构。因此,研究高脂饮食对颌骨代谢的影响及机制具有重要临床意义。细胞自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡,是一种广泛存在于真核细胞、且进化上高度保守的细胞降解过程。早在40年前就由Christian deDuve提出这一概念,但是真正在分子水平上阐明自噬的调节及机制的研究,都是在酵母中突破并完成的。到目前为止,已在酵母遗传筛选中鉴定了 32个不同的自噬相关基因(ATG)。ATG与细胞凋亡、衰老一样,参与机体各阶段的生长发育。近年来发现自噬在不同的成骨细胞、破骨细胞、骨细胞中均发挥着重要作用。自噬活性失调可能涉及骨骼相关性疾病的发生、发展。研究发现自噬与骨质疏松症关系密切,自噬相关基因的变异可能影响骨的形成及重建,导致骨密度下降,骨质疏松,易发生骨折。NF-κB做为转录因子蛋白家族成员之一,常以同源二聚体形式存在于大部分细胞内,参与免疫反应的早期阶段和炎症反应的各个阶段,影响细胞分化、凋亡、组织损伤及应激。研究发现NF-κB信号通路参与自噬活性的调控,自噬相关基因Beclin 1及ATG5的激活可导致NF-κB信号两个重要的调控因子IKK及NIK降解,而自噬抑制剂3-MA能够阻断这一过程。然而自噬是否影响高脂血症的颌骨骨结构,NF-κB信号通路是否参与其中,目前尚未见文献报道。本研究主要从以下三个部分进行。第一部分:高脂血症动物模型建立,通过长时间喂养SD大鼠高胆固醇饮食,模拟现代人的高脂饮食习惯,建立高脂血症动物模型;第二部分:高胆固醇饮食对大鼠下颌骨微结构的影响。在此动物模型基础上,利用qPCR、免疫组化、骨组织形态计量等方法,证实高胆固醇饮食对大鼠下颌骨结构的影响,探讨NF-κB信号通路参与调控高胆固醇饮食对下颌骨结构的改变以及辛伐他汀的治疗意义;第三部分:自噬参与高胆固醇饮食大鼠下颌骨结构改变的研究。利用qPCR、免疫组化等方法,研究在高胆固醇饮食及辛伐他汀药物干预情况下,自噬相关基因LC3、p62在大鼠下颌骨组织中的表达,分析自噬是否参与调控高胆固醇饮食对颌骨结构的改变,以期为高脂血症患者颌骨骨量丢失及代谢异常的治疗提供一个重要靶点,从而提高口腔种植及义齿修复的成功率,更好的满足患者对高品质生活的需求。方法:1.将30只SD大鼠随机分为三组,正常饮食组(NC)、高胆固醇饮食组(HC)、5mg/kg辛伐他汀+高胆固醇饮食组(HC+SIM)。每周测量体重,喂养32周后取空腹12小时的静脉血进行生化检测血清甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等指标,建立高脂血症动物模型。2.利用实时荧光定量PCR技术方法检测NC、HC、HC+SIM组的下颌骨组织炎症因子TNF-α、IL-1β的表达,分析炎症在高胆固醇饮食大鼠中的意义。3.将大鼠下颌骨组织固定、脱钙,HE染色,利用Image Pro Plus 6.0软件进行下颌骨骨组织形态计量,检测静态参数:骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁间距(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)进行统计学分析,明确高胆固醇饮食及辛伐他汀干预对大鼠颌骨微结构的影响。4.运用实时荧光定量PCR及免疫组化技术,分别检测NC、HC、HC+SIM组的下颌骨组织中RANKL、OPG基因的mRNA及蛋白表达水平,分析RANKL、OPG、RANKL/OPG在高胆固醇饮食大鼠颌骨组织中的变化及辛伐他汀的干预意义。5.运用qPCR及免疫组化技术,分别检测NC、HC、HC+SIM组的下颌骨组织中炎症信号NF-1κB的mRNA及蛋白表达水平,分析NF-κB信号是否参与调控高胆固醇饮食大鼠颌骨结构的改变。6.运用qPCR及免疫组化技术,分别检测NC、HC、HC+SIM组的下颌骨组织中自噬相关基因LC3及p62的mRNA及蛋白表达水平,证实自噬是否参与高胆固醇饮食大鼠颌骨结构的改变。结果:1.高胆固醇饮食大鼠的体重与正常组无明显统计学差异(P0.05),说明高胆固醇饲料喂养对大鼠体重无明显影响。甘油三酯检测结果显示正常组为1.35±0.48mmol/L,而高胆固醇组为1.07±0.39mmol/L,辛伐他汀干预组TG平均值为1.15±0.28mmol/L,三组间比较无显著统计学差异(P0.05)。总胆固醇检测结果显示正常组为2.07±0.28mmol/L,而高胆固醇组为5.10±1.26mmol/L,辛伐他汀干预组TC平均值为3.33±1.15mmol/L,三组间比较具有显著统计学差异(P0.001),高胆固醇组的总胆固醇高于其他组。低密度脂蛋白(LDL)平均值在正常组为0.44±0.11mmol/L,而高胆固醇组为2.09±0.75mmol/L,显著升高(P0.001),5mg/kg辛伐他汀灌胃8周后LDL平均值为1.36±0.75 mmol/L,与高胆固醇组比较具有显著统计学差异(P0.05)。高密度脂蛋白(HDL)在正常组为1.21±0.17mmol/L,而高胆固醇组为1.10±0.34mmol/L,5mg/kg辛伐他汀灌胃8周后HDL平均值为1.01±0.24mmol/L,三组相比较无显著统计学差异(P0.05);上述结果证实高脂血症动物模型成功建立。2.与正常饮食大鼠比较,高胆固醇饮食引起下颌骨组织炎症反应因子TNF-α、IL-1βmRNA表达水平升高,无统计学差异(P0.05),而辛伐他汀干预后,qPCR检测发现TNF-α、IL-1β较高胆固醇饮食组下降,但是无统计学差异(P0.05)。3.骨组织形态计量结果显示高胆固醇组大鼠下颌骨骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目分别为 19.03±8.62(%),26.36±7.46(μm),7.00±1.86(mm-1),与正常饮食组相比较明显下降,具有统计学差异(P0.001,P0.05,P0.001),辛伐他汀干预组 BV/TV、Tb.Th、Tb.N 分别为 43.98±15.76(%),37.58±20.27(μm),12.89±4.32(mm-1),与高胆固醇饮食组相比较均明显升高,具有统计学差异(P0.001,0.01,P0.001);高胆固醇饮食组 Tb.Sp 为 130.44±61.62(μm),较正常饮食组48.95±15.09(μm)显著升高(P0.001),辛伐他汀干预后Tb.Sp为48.50±20.32(μm),与高胆固醇饮食组相比具有明显差异性(P0.001);本结果证实高胆固醇饮食与下颌骨骨结构负性相关。4.荧光定量PCR及免疫组化检测大鼠下颌骨组织RANKL及OPG基因的mRNA及蛋白表达,发现高胆固醇饮食可以引起RANKL及OPG明显升高(P0.001,P0.05),RANKL/OPG比值显著升高(P0.05),而在辛伐他汀干预组,RANKL基因表达较高胆固醇饮食组明显降低,具有统计学差异(P0.05),OPG表达较高胆固醇饮食组下降,但是统计学分析无明显差异性,RANKL/OPG的比值较高胆固醇饮食组显著下降(P0.001);本结果说明高胆固醇饮食可能引起破骨细胞活性增加,破坏颌骨代谢的动态平衡。5.荧光定量PCR及免疫组化检测大鼠下颌骨组织NF-κB的mRNA及蛋白表达,显示高胆固醇组NF-κB明显升高,具有显著差异性(P0.05,P0.01),而辛伐他汀干预后,NF-κB基因表达明显下降,统计学检验具有差异性(P0.05,P0.05);说明NF-κB信号通路可能参与调控高脂血症对下颌骨骨密度的破坏。6.与正常组比较,在高胆固醇饮食组大鼠颌骨组织中LC3及p62 mRNA表达水平明显升高,统计学检验具有显著差异性(P0.01,P0.05);与正常组比较,高胆固醇组LC3及p62蛋白表达明显升高,统计学检验具有显著性差异(P0.05)。在辛伐他汀干预后,p62 mRNA表达明显下降,统计学检验具有显著性差异(P0.01),而LC3 mRNA表达水平降低,但是统计学检验无明显差异;利用Image Pro Plus 6.0软件对免疫组化进行分析,显示与高胆固醇饮食组比较,辛伐他汀药物干预后p62蛋白表达下降明显,统计学检验具有显著性差异(P0.001),而LC3蛋白表达降低,无明显统计学差异;本结果说明自噬参与高胆固醇喂养大鼠下颌骨骨组织的改变,初步阐明自噬参与调控高胆固醇血症大鼠下颌骨的代谢异常。结论:高胆固醇饮食喂养大鼠能够稳定建立高脂血症动物模型;高胆固醇饮食可以导致SD大鼠下颌骨微结构破坏,骨静态参数下降,RANKL/OPG比值下调,骨量下降。辛伐他汀药物可以通过抑制NF-κB信号,改善下颌骨微结构。在NF-κB信号通路介导下,自噬可能参与调控高脂血症大鼠颌骨微结构的改变。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R589.2
【部分图文】：

图１：?ＳＤ大鼠每周的体重。ＮＣ：正常组ＨＣ：高胆固醇组??Ｆｉｇｕｒｅ?１．?Ｔｈｅ?ｗｅｉｇｈｔ?ｏｆ?ＳＤ?ｒａｔｓ?ｅｖｅｒｙ?ｗｅｅｋ．?ＮＣ：?ｎｏｒｍａｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ；?ＨＣ：?ｈｉｇｈ??ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ．??７１??

图２．生化检测指标：在３２周测量血清甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、密度脂蛋白。ＮＣ：正常饮食组；ＨＣ：高胆固醇饮食组；ＨＣ＋ＳＩＭ组：５ｍｇ／ｋｇ辛伐他汀＋高胆固醇饮食组。＊?Ｐ?＜?０．０５；?＊＊尸＜?０．０１??Ｆｉｇｕｒｅ?２．?Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ?ｔｅｓｔ．?Ｓｅｒｕｍ?ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ?（ＴＧ）．?ｔｏｔａｌ?ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?（ＴＣ），??ｈｉｇｈ－ｄｅｎｓｉｔｙ?ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ?（ＨＤＬ）?ａｎｄ?ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ?ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ?（ＬＤＬ）?ｌｅｖｅｌｓ?ｉｎ?ｒａｔｓ??ａｓｓａｙｅｄ?ｉｎ?ｔｈｅ?３２ｔｈ?ｗｅｅｋ．?＂ＮＣ：?ｎｏｒｍａｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ；?ＨＣ：?ｈｉｇｈ?ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?ｄｉｅｔ?ｇｒｏｕｐ；??ＨＣ＋ＳＩＭ：?ｈｉｇｈ?ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ?ｄｉｅｔ＋ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ．?＊?尸?＜０．０５；?＊＊?尸＜?０．０１．??

图３．下颌骨组织的ＨＥ染色。Ａ，Ｂ：正常饮食组下颌骨组织的ＨＥ染色（Ａ，?Ｘ４０：??Ｂ，?Ｘ１００）；?Ｃ，?Ｄ：高胆固醇饮食组下颌骨组织的ＨＥ染色（Ｃ，Ｘ４０；?Ｄ，?Ｘ１００）；??Ｅ，?Ｆ：?５ｍｇ／ｋｇ辛伐他汀＋高胆固醇饮食组下颌骨组织的ＨＥ染色（Ｅ，?Ｘ４０；?Ｆ，??Ｘ１００）。ＮＣ：正常饮食组；ＨＣ：高胆固醇饮食组；ＨＣ＋ＳＩＭ组：５ｍｇ／ｋｇ辛伐他??汀＋高胆固醇饮食组。??Ｆｉｇｕｒｅ?３．?ＨＥ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｊａｗ?ｂｏｎｅ?ｔｉｓｓｕｅ．?Ａ，?Ｂ：?ＨＥ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｉｎ?ＮＣ?ｇｒｏｕｐ?（Ａ，?Ｘ４０；??７３??
【参考文献】

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本文编号：2863902