人工甜味剂通过甜味受体途径调节胰岛β细胞内分泌功能研究

发布时间：2020-11-17 20:17

　　 人工甜味剂,以其高甜度、无能量产生的特性成为各种天然糖类替代品,广泛应用于食品行业。近年来,愈来愈多的研究表明人工甜味剂能够破坏血糖耐受性,但具体机制尚不清楚。由α、β、δ等内分泌细胞组成的胰岛是动物及人类血糖平衡调节的重要器官,胰岛内分泌细胞通过释放如胰岛素,胰高血糖素等各类激素,调节机体的血糖动态平衡。甜味受体作为糖类及人工甜味剂感受器,已有部分研究表明甜味受体亚单位T1R2及下游信号转导蛋白α-gustducin存在于胰岛内分泌细胞中,可能介导胰岛内分泌细胞激素释放功能和胰岛血糖调节功能。但是,对于甜味受体T1R3/T1R2及甜味信号转导下游G蛋白α-gustducin在胰岛中的详细分布情况,人工甜味剂在胰岛内分泌细胞激素释调控中的功能尚不清楚。所以,本研究以野生型及甜味受体T1R3基因敲除小鼠为实验动物模型,利用胰岛分离、RT-PCR、免疫组化、HE染色及Elisa、激光共聚焦等实验技术,明确甜味受体T1R2/T1R3及下游信号转导蛋白α-gustducin在胰岛中的详细分布规律,阐明了人工甜味剂在胰岛β细胞胰岛素释放及葡萄糖诱导的胰岛素释放中的作用,明确了甜味受体在上述作用的重要作用,另外通过以三氯蔗糖为人工甜味剂代表,分析了人工甜味剂长期暴露后小鼠表型特征、血糖、胰岛素释放及胰岛形态特征变化。具体实验结果如下:1.甜味受体在小鼠胰岛内的表达与分布规律RT-PCR及免疫组化结果表明,胰岛特异性表达甜味受体及甜味信号转导蛋白α-gustducin;免疫双标结果表明甜味受体T1R3和T1R2广泛存在于小鼠胰岛α、β和δ细胞中,而甜味信号转导蛋白α-gustducin存在于α和δ细胞中。2.人工甜味剂增效葡萄糖诱导的β细胞胰岛素释放静态孵育结合动态灌注小鼠离体胰岛,ELISA分析胰岛素释放,结果表明人工甜味剂(三氯蔗糖、安赛蜜、糖精)单独刺激胰岛对β细胞胰岛素的释放无显著影响,但显著增效葡萄糖诱导的胰岛素释放。证明人工甜味剂诱导胰岛素释放的功效严重依赖于葡萄糖的存在。3.甜味受体T1R3的缺失减弱甜味剂协同葡萄糖诱导β细胞胰岛素释放作用以甜味受体T1R3基因敲除及同窝野生型小鼠为实验动物,分离胰岛,结合静态胰岛孵育和ELISA方法,发现甜味受体T1R3的缺失虽然对单一人工甜味剂(三氯蔗糖、安赛蜜、糖精)诱导的胰岛素分泌无影响,但显著减弱人工甜味剂协同葡萄糖诱导胰岛素释放的增效作用。这一结果揭示了胰岛中的甜味受体T1R3在调控胰岛素释放的通路机制中的重要作用。4.甜味受体T1R3缺失减少胰岛细胞密度及β细胞数量以甜味受体T1R3基因敲除及同窝野生型小鼠为实验动物,冰冻切片与免疫组化方法相结合,结果表明与野生型小鼠相比,甜味受体T1R3基因缺失小鼠胰岛的数量、胰岛中β细胞的数量显著减少,小鼠胰岛面积,胰岛α和δ细胞数量均有下调的趋势,但并没有明显差异。结合甜味受体T1R3基因敲除对人工甜味剂协同葡萄糖的增效作用影响,说明可能甜味受体T1R3基因敲除可能引发了小鼠胰岛的数量与胰岛中β细胞的数量的下降从而减弱了甜味剂诱导的胰岛素释放水平。5.长期三氯蔗糖暴露对小鼠血糖生理生化指标、葡萄糖耐受性、头期胰岛素释放及胰岛细胞密度的影响以三氯蔗糖连续暴露16周雄性C57BL/6小鼠为实验对象,暴露过程体重及摄食量跟踪表明三氯蔗糖摄入对小鼠体重及每日摄食量无显著影响,但因为三氯蔗糖溶液甜味特性,与对照组相比,显著增加每日溶液摄入量;暴露过程中血糖耐受实验表明三氯蔗糖暴露增强小鼠血糖耐受性,这种耐受性可能来自于三氯蔗糖长期暴露过程中,胰岛素头期释放水平的提高。总之,通过上述研究结果证明了甜味剂增效葡萄糖诱导的胰岛素释放,揭示了甜味受体T1R3在调控胰岛素释放的通路机制中的重要作用。而上述研究可能为未来血糖调控提供一个新的途径。
【学位单位】：浙江工商大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS202.3;R587.1
【部分图文】：

是动物体内最大的消化腺，具有一系列内分泌和外分泌（消化）分泌功能来自散布在腺体中的胰岛细胞，通过释放激素参与体内。??腺??外观呈粉红色，有明显的分叶状光滑表面。胰腺按形态主要部分，身体和尾部四个部分，其各个部分之间只有非常小的功能或解（如图１）。胰腺还具有一个附属叶（钩突过程），其在解剖学上和。对成人而言，胰腺的长度在１２到１５厘米之间，其形状为扁平的，内侧末端较厚的部位被称为胰头，朝向侧端较薄的部位被叫做分则是胰体。胰体与胰头的连接处有一个不同的细长收缩的结构，将其划分出来称为胰颈ｍ。胰腺随着动物年龄的增长，外分泌组，腺体内的脂肪结缔组织的量也会减少，这导致胰腺渐进性地变薄扫描中尤其明显。胰腺在动物体内的位置处于十二指肠的第一，的曲线内，并且横向地并略微向上延伸穿过后腹壁到胃后面的脾空间不是位于一个平面内，而是有效地“覆盖”在腹膜后和脊柱上【２１。??

浙、；丨：丄商大学硕Ｉ．：学位论文???最初由德国生物学家Ｐａｕｌ?Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ于１８６９发现｜４１，胰岛由至少五种内分泌细??胞类型组成，即ａ细胞，ｇ细胞，Ｓ细胞，ＰＰ细胞（Ｆ细胞）和ｅ细胞，分别??分泌胰高血糖素，胰岛素，生长激素抑制素，胰多肽和生长素释放肽。一般胰岛??细胞结构为Ｐ细胞优先聚集在结构的核心处，而ａ，Ｓ和ＰＰ细胞在外周排列［５］??（如图１－２所示）。虽然在所有研究的物种中，Ｐ细胞最丰富（５０－８０％），其次??是ａ细胞（２０－５０％?）１＆１，但是在胰岛细胞组成和结构上，物种之间存在显著差异。??例如，在人类和非人类灵长类动物中，ａ细胞分散在整个胰岛中而不是集中在外??周。Ｐ细胞的同型相互作用的百分比（与相同类型细胞相互作用的百分比）在人??胰岛中约为２９％，而在小鼠中则为７１％［７】。考虑到内分泌胰腺中细胞间交互的??复杂性，也许这种结构差异具有功能意义。Ｃａｂｒｅｒａ等Ｗ人的研究表明，对于啮??齿动物胰岛中高葡萄糖浓度的响应，膜电位和［Ｃａ２＋］的振荡是协调的，因此整个??胰岛显示出同步振荡响应。在人类胰岛中没有发生这种情况，这些反应不同步。??此类发现表明细胞分布模式（聚集与散射）和胰岛细胞功能之间存在相关性。胰??岛富含血管，以确保内分泌细胞有效地分泌激素进入血液。有研究显示，与周围??的外分泌组织相比，胰岛内血管的内部容积和微血管表面积增加了近两倍［９】。??

—＞?定位??？免疫荧光双标法??图２－１本章实验技术路线??Ｆｉｇ．２－１?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ?ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏｕｔｅ?ｏｆ?ｔｈｉｓ?ｃｈａｐｔｅｒ??２．３．２小鼠胰岛的分离??小鼠断颈致死后，酒精消毒小鼠腹部，小鼠腹腔打开，小鼠胰腺部位清洗可??见，随后将小鼠置于解剖镜下，用微型止血钳夹住十二指肠与总胆管交接的壶腹??处，用注射器（５ｍｌ，针头型号为３０Ｇ）从总胆管处逆行插入，将３ｍｌ胶原蛋白??酶ＸＩ消化液缓慢注入胰腺内，如示意图３－２所示，使胰腺组织均匀膨胀。快速摘??除胰腺放入２ｍｌ消化液的５０ｍｌ离心管中。将５０ｍｌ离心管放置３７．５°Ｃ的水浴锅??孵育１８ｍｉｎ?（若穿刺总胆管不顺利，胰腺膨胀不佳则需要适当增加孵育时间）。??在孵育过程中摇晃离心管２到３次。孵育完成后，摇晃离心管以分解胰腺直至悬??浮物变得均匀。将离心管放置于冰上并加入含１０％胎牛血清的ＨＢＳＳ缓冲液至??２０ｍｌ以终止消化。离心（２９０ｇ，３０ｓ，４°Ｃ），去除上清液。然后加入２０ｍｌ冷的含??１０％胎牛血清的ＨＢＳＳ缓冲液
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本文编号：2887870