BMSCs联合PTH治疗大鼠骨质疏松的实验研究

发布时间：2020-11-20 19:12

　　 第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养、鉴定、成骨诱导分化和USPIO标记目的:通过体外法分离、培养、扩增、鉴定及成骨诱导分化BMSCs,并对扩增的BMSCs行USPIO标记,观察BMSCs的生物学特性及USPIO标记后BMSCs的细胞活力。方法:1.在无菌条件下分离大鼠的股骨,采用全贴壁法培养、扩增BMSCs。2.通过流式细胞仪鉴定培养细胞的表面抗原,明确目的细胞的纯度。3.对扩增的BMSCs行成骨诱导分化,并分别行碱性磷酸酶和茜素红染色鉴定,观察其成骨分化能力。4.扩增的BMSCs行PLL转染的USPIO标记,普鲁士蓝染色法验证USPIO已成功转染到BMSCs细胞内。MTT法绘制标记细胞的生长曲线,明确USPIO对BMSCs增殖能力的影响;台盼蓝拒染色法检测标记细胞的生物活性。结果:1.提取细胞在24h后形态大小不均一,多为类球形,部分贴壁;培养48h后,绝大部细胞贴壁生长,形态呈纺锤形或梭形。2.流式细胞仪抗原表型检测结果示:培养细胞CD29(99.86%)、CD90(99.73%)阳性表达,几乎不表达CD34(6.48%)、CD45(0.94%),证明培养、扩增的细胞为BMSCs。3.BMSCs碱性磷酸酶染色后光镜下可见细胞团之间有灰黑色结节;茜素红染色后可见大片细胞红染及细胞间有红色矿化结节形成。4.USPIO标记后的BMSCs胞内可见淡黄色细小铁颗粒;细胞普鲁士蓝染色后胞质内大部呈蓝色。MTT法测得标记细胞前2天增殖速度慢,第3天进入增殖对数期,第4-5天为增殖平台期。经标记后的细胞台盼蓝拒染率高达97%。结论:1.全贴壁培养法能够成功培养、扩增合格的种子细胞。2.经诱导后的BMSCs可以产生钙结节,证明其具有成骨分化能力。3.USPIO能够高效的标记BMSCs,且对其增殖能力及生物学特性无影响,可以有安全地进行体外示踪。第二部分大鼠骨质疏松模型的构建及鉴定目的:通过切除雌性大鼠双侧卵巢的方法来诱导大鼠骨质疏松模型并鉴定骨松造模是否成功。方法:1.切除雌性大鼠双侧卵巢。2.通过大鼠雌激素ELISA试剂盒检测去势大鼠雌激素水平及通过Micro-CT测定股骨颈相关骨性指标:骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)等指标。结果:去势大鼠的雌激素水平降低明显;Micro-CT测定股骨颈骨性指标发现Tb.Th、Tb.N、BV/TV降低,而Tb.Sp升高。结论:通过切除雌性大鼠双侧卵巢的方法可以成功地构建大鼠骨质疏松模型。第三部分BMSCs联合PTH治疗大鼠骨质疏松的实验研究目的:将USPIO标记的BMSCs植入骨质疏松大鼠的股骨颈内并行MRI体外示踪,证明目的细胞成功植入大鼠体内。最后通过Micro-CT测定股骨颈骨性指标,观察BMSCs与PTH对骨松大鼠的治疗效果。方法:1.将50只雌性大鼠随机分为5组,术后12周,A、B组大鼠不做干预处理,其中A组为正常对照组,B组为骨质疏松空白对照组;C组(PTH干预组)按60μg/kg剂量背部皮下注射Rat PTH 1-34,隔日1次,连续注射12周;D组(BMSCs干预组)大鼠股骨颈注入0.5ml浓度为5×10~8个/ml的USPIO-BMSCs;E组(BMSCs联合PTH干预组)在D组的BMSCs干预的基础上同时施加PTH因素,注射浓度、剂量、频率与C组一致。2.所有大鼠均在干预12周后处死,Micro-CT测量五组大鼠股骨颈的骨性指标,观察成骨情况。结果:1.MRI示踪发现USPIO标记的BMSCs成功植入骨松大鼠股骨颈内。2.联合治疗组与单独治疗组比较,骨小梁几个参数明显改善,差异有统计学意义(P0.05),但仍然达不到A组水平。结论:BMSCs联合PTH治疗局部骨质疏松的效果优于单独使用治疗的效果。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R580
【部分图文】：

山西医科大学硕士学位论文的旋涡状细胞团，以长梭形为主的细胞高倍镜下可见粗细不一的细胞富，胞核清晰。7 天后细胞生长较 4 天时更为密集，融合成片状，约的 80%-90%，呈旋涡状同方向排列（见图 1-1）。传代培养的细胞较原快，12 h 后可全部贴壁，且细胞形态更为均一，3 天即可铺占培养瓶试将细胞连续扩增至 19 代，其子代细胞形态仍呈梭形，且生长速度及降。

BMSCs 40× BMSCs 400×图 1-1 光镜不同放大倍数下的 BMSCsBMSCs 的成骨分化能力鉴定第三代 BMSCs 行成骨诱导分化约 10 d 后，碱性磷酸酶染色可见深蓝色块状结节（如图 1-2 所示）；诱导培养约 21d 后，行茜素红染色后光镜红染矿化钙结节（如图 1-3 所示），两种染色结果都证明所培养的 BM分化能力。

BMSCs 40× BMSCs 400×图 1-1 光镜不同放大倍数下的 BMSCsBMSCs 的成骨分化能力鉴定第三代 BMSCs 行成骨诱导分化约 10 d 后，碱性磷酸酶染色可见深蓝色块状结节（如图 1-2 所示）；诱导培养约 21d 后，行茜素红染色后光镜红染矿化钙结节（如图 1-3 所示），两种染色结果都证明所培养的 BM分化能力。
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本文编号：2891864