FoxO1过表达对糖尿病大鼠肾脏系膜细胞增殖及细胞外基质堆积的影响及机制研究

发布时间：2017-04-11 14:26

  本文关键词：FoxO1过表达对糖尿病大鼠肾脏系膜细胞增殖及细胞外基质堆积的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的 糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病的主要慢性并发症，系膜细胞过度增殖在糖尿病肾病发生发展中起着重要作用[1,2]。叉头状转录因子O1（Forkhead transcription factor O1, FoxO1）是FoxO亚家族中的一员，主要通过PI3K/AKT信号通路聚集细胞内外的多重下游信号分子，调节细胞内外应激信号之间的平衡，在抗氧化应激，调节糖脂代谢及细胞周期调控等方面有着重要的作用[3,4]。目前关于FoxO1调控细胞周期，抑制细胞增殖的研究主要集中于抗肿瘤方面，而其与糖尿病肾病中系膜细胞增殖的关系，研究较少。本课题组既往研究发现，在糖尿病大鼠肾皮质内，FoxO1mRNA水平降低，其蛋白磷酸化水平增高，病理显示系膜细胞过度增生，细胞外基质堆积，表明FoxO1与糖尿病肾病发生发展有着重要关系。 p27Kip1是一种细胞周期依赖性激酶抑制剂，可以抑制多种细胞的增殖，其在调节细胞增殖，分化，凋亡方面有着举足轻重的作用。研究表明，p27Kip1作为FoxO1重要的下游靶基因，其表达的降低与多种肿瘤的发生密切相关[5,6]。因此，在糖尿病大鼠体内，FoxO1是否是通过调节p27Kip1的表达来抑制系膜细胞的增殖，从而减轻糖尿病肾脏病变，目前尚不清楚。本研究在动物体内，通过大鼠肾脏靶向性注射慢病毒，上调FoxO1的表达及活性，从而观察其对肾脏系膜细胞增殖及细胞基质堆积的影响并探讨其可能机制。 材料与方法 构建空慢病毒载体（LV-NC-GFP）及大鼠组成性激活突变型FoxO1慢病毒载体（LV-CA-FoxO1）。8周龄健康SPF级雄性SD大鼠，体重（220±20）g，适应性喂养1周，室温25℃，昼夜交替12小时，随机选取100只构建糖尿病大鼠模型，30只作为正常对照组。造模方法如下：禁食12小时后，按60mg/kg一次性腹腔注射1％STZ溶液,正常组注射相当体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，72小时后连续3次测量血糖（Blood Glucose, BG），BG≥16.7mmol/L为成模标准（4只失败），将成模糖尿病大鼠随机分为2周，4周，8周3个时期，各时期分为3组：糖尿病组（DM组），糖尿病FoxO1过表达转染组（CA组）和糖尿病空病毒转染组（NC组）。以糖尿病大鼠右侧背部为手术入口，，暴露大鼠右侧肾脏，肾脏皮质多部位注射组成性激活突变型FoxO1慢病毒载体或空病毒载体100μl，DM组注射同等体积的生理盐水，然后逐层缝合。于病毒注射后2周、4周、8周末，代谢笼收集24小时尿，用于测定24小时尿蛋白（UPro/24h）及尿白蛋白定量（UAIb）。称量体重（Body Weight, BW）后用水合氯醛麻醉大鼠，眼眶取血，分离血清检测血肌酐（serum creatinine, Scr）及尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）。剥离右肾，称重并计算肾重指数（kidney weight/body weight ratio, KI）后取注射部位肾皮质加OCT混合物（opti-mum cutting temperature compound）迅速于液氮中冷冻，制备冰冻切片，倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GreenFluorescent Protein, GFP）表达，以确定慢病毒是否转染成功。取注射部位约1mm3大小肾皮质置于4%预冷戊二醛固定用于电子显微镜检查，取部分肾皮质于4%多聚甲醛中固定用于HE染色和免疫组化检查。剩余肾皮质迅速置于液氮中保存，荧光定量PCR检测肾皮质中FoxO1、p27Kip1、纤溶酶原激活物抑制物（Plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）、纤连蛋白（Fibronectin, FN）、肾小球胶原Ⅳ（Collagen Ⅳ, Col Ⅳ）mRNA表达水平。Western bloting检测肾皮质中FoxO1、磷酸化FoxO1（p-FoxO1）、p27Kip1、PAI-1蛋白表达。免疫组化检测FN、ColⅣ表达情况。 结果 1.2周，4周，8周糖尿病大鼠肾皮质冰冻切片于倒置荧光显微镜下均可以观察到大量GFP表达，说明慢病毒载体成功转染大鼠肾皮质并稳定表达外源基因。 2.与NG组比较，DM组及NC组大鼠精神萎靡、饮水量及尿量多、垫料潮湿。CA组精神接近于正常组大鼠，而饮水量和尿量仍然较高,垫料较潮。与NG组相比，DM组各时间段体重（Body weight, BW）明显降低，BG、肾重指数（kidneyweight/body weight ratio，KI）升高(P0.05)，其中2周时UPro/24h、UAlb、Ser、BUN无显著性差异(P＞0.05)。4周，8周时，上述指标逐渐升高(P0.05)。CA组与DM组相比，2周时各指标无显著性差异（P＞0.05），而4周，8周时KI、UPro/24h、UAlb、Ser、BUN均明显降低（P 0.05），BW、BG比较无显著学差异（P0.05）。NC组与DM组比较各指标之间差异无统计学意义（P0.05）。 3. HE染色显示NG组大鼠肾小球结构清晰；DM组与NC组大鼠肾小球系膜细胞明显增生，系膜基质增多，CA组上述病理改变明显减轻。电镜超微结构显示NG组肾小球基底膜厚度均一，足突分布均匀，无微绒毛化，系膜细胞及基质无增生；DM组与NC组大鼠随时间进展基底膜增厚或者不光滑，足突融合逐渐加重，系膜细胞及基质结节性增生；CA组大鼠足突融合改善，系膜细胞及基质轻度增生。 4.与NG组相比，DM组各时间段FoxO1、p27Kip1的mRNA表达明显降低(P0.05)，PAI-1、FN、Col Ⅳ mRNA表达升高(P0.05)。CA组较DM组FoxO1、p27Kip1mRNA水平明显升高(P0.05)。PAI-1、FN、Col Ⅳ mRNA表达则显著降低(P0.05)。 5.各时间段，与NG组相比，DM组FoxO1表达无显著性差异(P0.05)，而p-FoxO1及p-FoxO1/FoxO1比值明显增加(P0.05)，CA组较DM组FoxO1表达明显升高，p-FoxO1表达无差异(P0.05)，p-FoxO1/FoxO1比值则显著降低(P0.05)，上述结果表明肾脏转染FoxO1慢病毒后其表达及活性显著升高。与NG组相比，DM组p27Kip1蛋白表达明显降低(P0.05)，PAI-1表达升高(P0.05)，CA组较DM组p27Kip1蛋白表达明显升高(P0.05)，PAI-1表达明显降低(P0.05)， NC组与DM组之间各指标无显著性差异(P0.05)。 6.免疫组化显示，随时间进展，DM组FN及Col Ⅳ表达逐渐升高(P0.05)。CA组上述指标表达明显降低(P0.05)。NC组与DM组比较各指标无显著性差异(P0.05)。 结论 1.糖尿病大鼠肾皮质内FoxO1mRNA水平降低，蛋白磷酸化水平增加，系膜细胞增生加重，系膜基质堆积。 2.提高糖尿病大鼠肾皮质FoxO1表达后，系膜细胞增生减轻，基质堆积减少，可能是通过调节p27Kip1以及PAI-1的表达实现的。
【关键词】：叉头状转录因子O1 糖尿病大鼠 系膜细胞 细胞增殖 慢病毒
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文缩略词14-16
• 前言16-18
• 材料与方法18-31
• 结果31-35
• 讨论35-38
• 结论38-39
• 附图39-46
• 参考文献46-48
• 综述部分 叉头状转录因子 FOXOS 和糖尿病及糖尿症并发症48-64
• 参考文献57-64
• 个人简历及攻读硕士期间发表论文64-65
• 致谢65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 李养军;惠延年;;高糖诱导牛视网膜微血管周细胞FOXO1A表达增加[J];国际眼科杂志;2007年02期

2 李养军;惠延年;;STZ诱导糖尿病视网膜FOXO1A的表达[J];眼科新进展;2007年07期

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本文编号：299305