人TSHR A亚基在大肠杆菌中的表达及免疫活性分析

发布时间：2021-01-31 01:02

　　人促甲状腺激素受体A亚基（TSHR A）在促甲状腺素受体抗体（TRAb）的产生、Graves病患者血清中促甲状腺素受体抗体（TRAb）的检测、Graves病可能的免疫治疗等方面均有重要意义。鉴于天然TSHR A亚基无法获得,真核体系表达所获得的融合蛋白产量甚微。获取充分TSHR蛋白A亚基成为Graves病诊治和研究的热点、难点,为此,本研究采用分子生物学技术,试图建立TSHR A亚基的原核表达体系,在大肠杆菌表达和获取TSHR A亚基片段。目的构建人促甲状腺激素受体（TSHR）A亚基的原核表达载体pET102/D-TOPO/TSHR A,在大肠杆菌中表达并分析其免疫活性。方法采用聚合酶链式反应扩增TSHR A基因编码序列,定向连接到载体pET102/D-TOPO中,经聚合酶链式反应、酶切、测序鉴定后转化大肠杆菌BL21Star^TM（DE3）;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达TSHR A融合蛋白,超声裂解细菌,SDS-PAGE、Western-Blot对其进行鉴定,在变性、复性、镍柱纯化后,目的蛋白与Graves病人血清结合鉴定其免疫活性。结果成功构... 

【文章来源】：兰州大学甘肃省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

TSHRA、B亚基结构示意图

兰州大学硕士研究生学位论文人促甲状腺激素受体A亚基在大肠杆菌中的表达及免疫活性分析12图2Pet102/D-TOPO原核表达质粒图谱2.1.2主要试剂PrimeSTARHSDNAPlomerase，宝生物工程（大连）有限公司dNTP，宝生物工程（大连）有限公司琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司质粒小提试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司限制性内切酶SacⅠ酶，宝生物工程（大连）有限公司DNAmarker2000宝生物工程（大连）有限公司（2000，1000，750，500，250，100），卡那霉素，北京索莱宝有限公司氨苄青霉素，北京索莱宝有限公司PBS缓冲液，北京索莱宝有限公司IPTG，北京索莱宝有限公司盐酸胍，甘肃伟博鑫有限公司Tis-HCI，北京索莱宝有限公司咪唑，北京索莱宝有限公司EDTA北京索莱宝有限公司30%丙烯酰胺，北京索莱宝有限公司1.5MTris-HCL（PH8.8），北京索莱宝有限公司1MTris-HCL（PH6.8），北京索莱宝有限公司10%SDS，北京索莱宝有限公司过硫酸铵，北京索莱宝有限公司TEMED，北京索莱宝有限公司脱脂奶粉，北京索莱宝有限公司

兰州大学硕士研究生学位论文人促甲状腺激素受体A亚基在大肠杆菌中的表达及免疫活性分析28增加，所以最佳诱导时间应5h。见图8、9。0h#，未诱导；1-8h#，为诱导时间1-8小时图8鼠抗HIS单克隆抗体WesternBlot诱导时间的检测图9IPTG诱导时间对蛋白表达量影响的柱状图3.6.2IPTG浓度对蛋白表达量的影响鼠抗HIS单克隆抗体WesternBlot结果经ImageJ软件其灰度值的分析及excel软件柱状图分析显示：TSHRA亚基蛋白在IPTG浓度为0.1mmol/L时已经开始表达，表达量随IPTG浓度增高而逐渐增加，但当IPTG终浓度为0.5mmol/L时，目的蛋白表达量达到峰值,此后再继续提高IPTG终浓度，目的蛋白表达量不再有明显增加，所以最佳IPTG浓度应为0.5mmol/L。见图10、11。1#：未诱导；2-9#：0.1mmol/L-0.8mmol/LIPTG诱导


本文编号：3009919