利用CRISPR/Cas9技术构建ApoE基因敲除的金黄仓鼠高脂血症模型

发布时间：2021-03-26 07:28

　　目的:高脂血症是一种由基因和环境因素共同引起的代谢性疾病,其主要危害是易引发动脉粥样硬化病变,由此导致的慢性心脑血管疾病已经是威胁人类健康的重要疾病之一。合适的动物模型是研究疾病的重要工具,本文主要是利用CRISPR/Cas9技术来建立ApoE基因敲除的新型金黄仓鼠高脂血症模型,并鉴定其表型。方法:载脂蛋白E（ApoE）是参与脂质代谢的一个关键基因。本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计了2对靶向金黄仓鼠ApoE基因第4个外显子的sg RNA（sg RNA 1,sg RNA2）。通过酶切和连接反应把合成的sg RNA序列连接到PX458质粒上构建sg RNA-质粒载体,Sanger测序和酶切反应验证质粒载体的正确性。用sg RNA-质粒载体转染BHK-21细胞后,通过荧光强度以及酶切反应验证sg RNA的敲除效率,选择效率高的sg RNA用于受精卵显微注射。把注射后的受精卵移植到代孕金黄仓鼠中,约2周后幼崽金黄仓鼠（即F0代）出生。待F0代金黄仓鼠生长至2周龄时,剪取脚趾做标记并收集脚趾组织用于提取基因组DNA和PCR扩增。PCR产物纯化后做载体克隆,挑取单克隆做Sange... 

【文章来源】：郑州大学河南省 211工程院校

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

ApoE基因打靶模式图

第一章构建ApoE基因敲除的金黄仓鼠17图1.2载体验证及体外效率检测。用Sanger测序（A-B）和酶切分析（C）验证sgRNA质粒载体；（D）sgRNA质粒载体转染BHK-21细胞；（E）酶切验证sgRNA在BHK-21细胞中的工作效率。Fig1.2TheefficiencyofsgRNAinvitro.VerificationofthesgRNA-plasmidvectorbySangersequencing(A-B)andCleavageassay(C)；(D)BHK-21cellstransfectedbysgRNA-plasmidvector.(E)TheefficiencyofsgRNAinBHK-21cellbyCleavageassay.3.2F0代金黄仓鼠基因型鉴定通过显微注射技术把sgRNA2质粒载体注射到53枚金黄仓鼠受精卵中，最后胚胎移植46枚。16天后出生6只F0代金黄仓鼠，其中雌性4只（F0-1、F0-3、F0-5、F0-6）雄性2只（F0-2、F0-4）。3周后采集剪去的金黄仓鼠脚趾组织并提取基因组DNA并进行PCR扩增。纯化后的PCR产物进行载体克隆，利用Sanger测序来检测F0代金黄仓鼠的基因型。结果如图1.3所示，6只F0代金黄仓鼠中有一只（F0-6）其基因型为野生型，其余5只F0金黄仓鼠的ApoE基因均被成功修饰，编辑效率为83.3%（5/6）；这5只仓鼠中共检出包括7种突变基因型。其中F0-1和F0-2个体均只携带1个突变基因型，分别删除了79个碱基和12个碱基；F0-3个体携带2个突变基因型，分别为删除了1个和21个碱基；F0-4个

第一章构建ApoE基因敲除的金黄仓鼠18体携带3个突变基因型，分别为删除了1、3、7个碱基；F0-5个体携带2基因型，其中一个删除了7个碱基，而另外一个为插入了1个碱基。图1.3F0代金黄仓鼠基因型检测。红色代表PAM序列，蓝色代表sgRNA打靶序列，紫色代表插入碱基。Fig.1.3ValidationofthegenotypesofallF0usingSangersequencing.sgRNAtargetsitesandPAMsequencesareshowinredandbluelettersrespectively,thebaseCinpurpleofF0-5indicatedthesinglebaseinsert.


本文编号：3101221