TGF-β介导马凡氏综合征主动脉血管平滑肌细胞衰老的机制研究

发布时间：2021-05-21 11:39

　　目的:成人主动脉根部扩张及主动脉瘤的形成是马凡氏综合征最常见的心血管症状及并发症;主动脉血管壁中膜平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）功能障碍是导致病变的关键因素。本研究探讨TGF-β介导马凡氏综合征主动脉VSMCs衰老的机制,为临床上马凡氏综合征主动脉病变的早期干预和治疗提供新的策略和理论基础。方法:分别选取临床上器官捐献供体和行主动脉手术的马凡氏综合征患者主动脉组织,然后分离、培养、鉴定两组主动脉VSMCs。运用H&E染色、SA-β-gal染色、Ki67增殖实验、免疫荧光染色比较两组主动脉组织中膜VSMCs增殖及衰老情况的差异。ELISA检测对比两组细胞培养基中衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）IL-6、IL-8、TNF-α、INF-y的浓度。将供体血管平滑肌细胞分为三组,其中两组分别加入TGF-β1（50ng/ml）和TGF-β1+TGF-β1-siRNA干预48 h后检测三组细胞衰老程度的情况,探讨TGF-β诱导主动脉VSMCs衰老的作用。运用DH... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：106 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 马凡氏综合征及其并发症
    1.2 血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)损伤与主动脉瘤
        1.2.1 VSMCs
        1.2.2 VSMCs损伤与主动脉瘤的形成
    1.3 转化生长因子-β及其生物学功能
    1.4 ROS/NF-κB信号通路与细胞衰老
        1.4.1 活性氧
        1.4.2 核转录因子κB(NF-κB)
        1.4.3 衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)
    1.5 研究假设
第二章 马凡氏综合征主动脉组织与供体主动脉组织衰老表型的比较
    2.1 前言
    2.2 组织标本和实验材料
        2.2.1 主动脉组织
        2.2.2 实验试剂
        2.2.3 实验材料与设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 主动脉组织的石蜡包埋
        2.3.2 苏木素伊红染色(hematoxylin and eosin staining,H&E staining)
        2.3.3 总蛋白质的提取
        2.3.4 蛋白质浓度测量
        2.3.5 蛋白质垂直凝胶电泳分离
        2.3.6 转膜
        2.3.7 封闭、孵育及显色分析
        2.3.8 主动脉组织切片的SA-β-gal染色
        2.3.9 主动脉组织切片衰老相关蛋白p53和平滑肌细胞标记蛋白α-SMA的免疫荧光染色
        2.3.10 统计方法
    2.4 实验结果
        2.4.1 MFS患者及器官捐献供体的基本信息
        2.4.2 MFS患者主动脉中膜发生囊性变并出现退化
        2.4.3 MFS患者主动脉组织中细胞衰老相关蛋白表达增多
        2.4.4 MFS患者主动脉组织中发生衰老的细胞类型主要为中膜平滑肌细胞
    2.5 实验讨论
    2.6 本章小结
第三章 马凡氏综合征及供体主动脉血管平滑肌细胞衰老表型的比较
    3.1 前言
    3.2 实验材料
        3.2.1 实验试剂
        3.2.2 实验材料与设备
    3.3 实验方法
        3.3.1 主动脉血管平滑肌细胞的分离和培养
        3.3.2 细胞的冻存
        3.3.3 细胞的复苏
        3.3.4 两组培养细胞α-SMA和calponin免疫荧光染色鉴定
        3.3.5 两组VSMCs形态大小的比较
        3.3.6 两组VSMCs SA-β-gal染色
        3.3.7 ki67免疫荧光染色比较两组VSMCs的增殖能力
        3.3.8 Western Blot法检测两组VSMCs中p53及p21的水平
        3.3.9 ELISA检测两组VSMCs培养基中衰老相关分泌表型(SASP)水平
        3.3.10 统计方法
    3.4 实验结果
        3.4.1 器官捐献供体与MFS患者主动脉血管平滑肌细胞的鉴定
        3.4.2 MFS-VSMCs体积增大,SA-β-gal染色阳性率增高,细胞增殖能力降低
        3.4.3 MFS-VSMCs衰老相关蛋白p21、p53的表达增多
        3.4.4 MFS-VSMCs培养基中SASP(IL-6、IL-8、TNF-α、INF-γ)浓度升高
    3.5 实验讨论
    3.6 本章小结
第四章 TGF-β1诱导主动脉血管平滑肌细胞衰老的研究
    4.1 前言
    4.2 实验材料
        4.2.1 实验试剂
        4.2.2 实验材料和设备
    4.3 实验方法
        4.3.1 MFS患者与器官捐献供体血清和主动脉组织中TGF-β1水平的测定
        4.3.2 Western Blot检测两组血管平滑肌细胞中TGF-β1的水平
        4.3.3 siRNA(Small-interfering RNA)沉默目的蛋白基因表达
        4.3.4 Western Blot检测各组Control-VSMCs干预后TGF-β1、p53、p21水平的变化
        4.3.5 SA-β-gal染色检测各组Control-VSMCs干预后的衰老情况
        4.3.6 统计方法
    4.4 实验结果
        4.4.1 MFS患者的血清和主动脉组织中TGF-β1水平升高
        4.4.2 TGF-β1促进Control-VSMCs衰老
    4.5 实验讨论
    4.6 本章小结
第五章 TGF-β促进血管平滑肌细胞衰老机制的探讨
    5.1 前言
    5.2 实验材料
        5.2.1 实验试剂
        5.2.2 实验材料和设备
    5.3 实验方法
        5.3.1 DHE染色检测MFS患者与器官捐献供体主动脉组织中ROS的水平
        5.3.2 线粒体活性氧水平的检测(Mito-Sox染色)
        5.3.3 两组VSMCs NF-κB活化情况比较(p-65- NF-κB免疫荧光染色)
        5.3.4 Western Blot检测各组VSMCs干预后目的蛋白表达水平变化
        5.3.5 SA-β-gal检测各组Control-VSMCs干预后的衰老情况
        5.3.6 ELISA检测各组Control-VSMCs干预后培养基中SASP的浓度
        5.3.7 统计方法
    5.4 实验结果
        5.4.1 MFS患者主动脉组织及细胞线粒体中ROS水平升高
        5.4.2 TGF-β1促进Control-VSMCs线粒体活性氧产生
        5.4.3 TGF-β1通过ROS/NF-κB信号通路促进VSMCs衰老
    5.5 实验讨论
    5.6 本章小结
结论
全文总结
参考文献
文献综述
    参考文献
攻读博士学位期间成果
致谢



本文编号：3199641