miR-124-3p在原代小鼠肝细胞重编程为胰岛素分泌细胞过程中的关键调控作用研究

发布时间：2021-10-21 16:39

　　目的:通过小分子化合物分阶段将小鼠肝细胞重编程为胰岛素分泌细胞（insulin producing cells,IPCs）,建立一种用非转基因方式重编程原代肝细胞为胰岛素分泌细胞的方法并探索miRNA-124-3p在诱导分化过程中的机制。方法:小鼠原代肝细胞分离、培养、鉴定,利用各类小分子化合物分阶段将肝细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞,通过qPCR、细胞免疫荧光检测分化各阶段标志物的表达,通过胰岛素释放实验检测IPCs的功能。设计miRNA-124-3p类似物（mimic）和抑制剂（inhibitor）序列,将mimic和inhibitor分别转染至小鼠肝细胞,并通过qPCR检测转染后miRNA-124-3p和靶基因Foxa2表达量变化,以此来判断载体是否构建成功,再将miR-124-3p上调和下调后的肝细胞诱导分化为IPCs,采用qRT-PCR,细胞免疫荧光检测miRNA-124-3p上调及下调后诱导各阶段胰岛素发育相关基因及蛋白表达量变化。小鼠胰岛素酶联免疫分析（ELISA）检测各阶段细胞分泌胰岛素的差异。结果:1.糖原染色显示分离得到的细胞为含有糖原颗粒的肝细胞,通过细胞免疫荧光染... 

【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

小鼠原代肝细胞的形态观察及鉴定A小鼠肝细胞的形态(Scalebar400μm)；B糖原染色鉴定肝细胞(Scalebar100μm)；C细胞免疫荧光检测肝细胞标志蛋白CK18和ALB的表达(Scalebar100μm)

第 3 章 结果形态变化细胞F1代在第一阶段经基础诱导培养基和小分子化合物、TSA 诱导培养 1 天后，显微镜下观察细胞增殖明显降低梭形，细胞质变扁平，核变大，细胞呈现出一种去分化成诱导第一阶段细胞（图 2B）；经基础诱导培养基中加 子作用 7 天后得到诱导第二阶段的细胞，即胰腺前体细，细胞仍呈梭形，细胞体积缩小，细胞之间间隙增大（图诱导第二阶段基础培养基及小分子化合物 NA 作用下，经成 IPCs，此时细胞数量较前几个阶段减少显著，细胞核浆细胞逐渐聚集成簇（图 2D）。

第 3 章 结果的肝细胞表面标志物ALB和AFP的表达明显下调，多谱系前体细胞标志物nestin和肝胰肠祖细胞标志物 Sox9 表达显著上调（图 3A），说明具备了多能祖细胞的特性。在第二阶段诱导结束后，检测到下调的 Sox9 和 nestin，以及与多能祖细胞相比上调的 Pdx1，Ngn3 和 NeuroD (图 3B)表达，显示胰腺祖细胞的成功诱导。经过第三阶段进一步的诱导分化，在 IPCs 中观察到 Pdx1，Ngn3 和 NeuroD，特别是 NeuroD 的显著降低。还有 β 细胞功能相关基因 GK，Glut2 和 insulin1 基因的表达在第 3 阶段的细胞中比在第 2 阶段的细胞上调(图 3C)，诱导分化过程中无胰高血糖素（glucagon）、生长抑素（somatostatin）、胰多肽（PP）等胰腺内分泌相关基因和胰腺外分泌基因淀粉酶（amylase）的表达（图 3D）。

【参考文献】：
期刊论文
[1]敲低赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD1）促进人诱导性多能干细胞分化为产胰岛素细胞[J]. 周淑艳,李富荣,李阳,张翠,孙瑶,张根葆.  细胞与分子免疫学杂志. 2018(08)
[2]小分子化合物对小鼠肝细胞分化为胰岛素分泌细胞的体外诱导作用[J]. 廖菁菁,郝好杰,刘建萍.  广东医学. 2015(14)
[3]重组hFOXA2和hPDX1慢病毒载体诱导乳牙牙髓干细胞重编程为胰岛素生成样细胞[J]. 石建峰,朱春晖,刘瑾,孙俊毅,饶国洲,李昂.  上海口腔医学. 2013(06)



本文编号：3449355