sTNFRⅡ-Fc融合蛋白修饰的人脐带来源间充质干细胞对小鼠胶原性关节炎的作用及其部分机制

发布时间：2021-10-29 16:36

　　类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种以关节滑膜炎症为主要病理表现的炎性、慢性、系统性自身免疫病,其发病机制可能与T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞和成纤维样滑膜细胞等各种细胞、炎症细胞因子共同作用有关,目前还没有令人满意的治疗方法。肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）在RA的发病机制中扮演重要角色,其与细胞上的肿瘤坏死因子受体（tumour necrosis factor receptor,TNFR）结合,在诱导RA炎症介质的产生、炎症细胞浸润、滑膜血管翳形成、骨侵蚀等病理生理过程中起重要作用。临床上,以依那西普（Etanercept）为代表的TNF-α抑制剂,在治疗中重度和难治性RA中起到举足轻重的作用。Etanercept是人可溶型肿瘤坏死因子受体Ⅱ（soluble tumour necrosis factor receptorⅡ,sTNFRⅡ）与人免疫球蛋白（immune globulin,Ig）G1的Fc段构建的融合蛋白,作为一种假受体,通过竞争性地结合TNF-α,阻断了TNF-α信号的传递,从而抑制... 

【文章来源】：安徽医科大学安徽省

【文章页数】：153 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
英文缩略词表(ABBREVIATION)
中文摘要
ABSTRACT
1 前言
2 实验材料
    2.1 人滑膜组织样本
    2.2 细胞
    2.3 动物
    2.4 药物与试剂
    2.5 仪器
3 实验方法
    3.1 人脐带间充质干细胞的培养和传代
    3.2 人脐带间充质干细胞的冻存和复苏
    3.3 人脐带间充质干细胞的鉴定
        3.3.1 表面分子标记物的检测
        3.3.2 成骨能力检测
        3.3.3 成脂能力检测
        3.3.4 成软骨能力检测
    3.4 STNFRⅡ-FC过表达慢病毒载体的构建、包装和检测
        3.4.1 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒克隆的构建
        3.4.2 sTNFRⅡ-Fc蛋白表达检测
        3.4.3 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体的包装
        3.4.4 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体的质量检测
    3.5 STNFRⅡ-FC过表达UC-MSC稳定细胞株(STNFRⅡ-MSC)的构建
        3.5.1 筛选稳定细胞株的puro最佳浓度
        3.5.2 确定UC-MSC的最佳转染条件
        3.5.3 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒转染UC-MSC
        3.5.4 sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株的筛选和扩大培养
        3.5.5 稳定细胞株纯度检测
    3.6 STNFRⅡ-MSC体外功能特性的确定
        3.6.1 ELISA法检测sTNFRⅡ-MSC分泌sTNFRⅡ-Fc的水平
        3.6.2 sTNFRⅡ-MSC表面分子标记物的检测
        3.6.3 sTNFRⅡ-MSC分化能力的检测
        3.6.4 MSC条件培养基的获取
        3.6.5 激光共聚焦法检测sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 的表达
        3.6.6 Western Blot法检测sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 的表达
        3.6.7 ELISA检测sTNFRⅡ-MSC与 FLS共培养体系中RANKL和OPG的水平
    3.7 STNFRⅡ-MSC体内功能特性的确定
    3.8 STNFRⅡ-MSC对小鼠CIA的作用
        3.8.1 制备小鼠CIA模型
        3.8.2 实验分组和给药方法
        3.8.3 整体指标观察
        3.8.4 踝关节病理学检测和评分
        3.8.5 脾脏病理学检测和评分
        3.8.6 免疫学指标检测
        3.8.7 免疫组化法检测踝关节软骨和滑膜组织中MMP-13、TIMP-1、ADAMTS-5和CollagenⅡ的表达
    3.9 QPCR法检测STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏CD4+T 细胞亚群相关转录因子mRNA表达的影响
        3.9.1 sTNFRⅡ-MSC与 CIA小鼠脾脏CD4+T 细胞共培养
        3.9.2 小鼠脾脏CD4+T 细胞RNA的提取
        3.9.3 RNA逆转录成c DNA
        3.9.4 Th17、Th1、Th2、Treg和 Tfh相关转录因子引物序列
        3.9.5 QPCR法检测CD4+T 细胞相关转录因子m RNA表达
    3.10 免疫荧光法检测STNFRⅡ-MSC在 CIA小鼠脾脏和关节组织中的留存时间
    3.11 免疫荧光法检测CIA小鼠脾脏留存的STNFRⅡ-MSC中LC3B-Ⅱ和Cleaved caspase3 表达情况
    3.12 TUNEL法检测STNFRⅡ-MSC凋亡
    3.13 Annexin V/PI法检测STNFRⅡ-MSC凋亡
    3.14 Western Blot法检测STNFRⅡ-MSC中 Bax、Bcl2、Caspase8、Caspase3、Cleaved caspase8、Cleaved caspase3、LC3B-Ⅱ和TRIB3的蛋白表达
    3.15 CCK-8 法检测自噬和凋亡对STNFRⅡ-MSC免疫抑制能力的影响
    3.16 Western Blot法检测STNFRⅡ-MSC中 SOX-9和Aggrecan蛋白表达
    3.17 统计学分析
4 结果
    4.1 UC-MSC的鉴定
    4.2 STNFRⅡ-FC过表达慢病毒载体的构建、包装和检测
        4.2.1 GV358载体酶切结果
        4.2.2 sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因片段的获取
        4.2.3 sTNFRⅡ-Fc融合蛋白基因与载体进行交换
        4.2.4 阳性克隆测序
        4.2.5 质粒表达检测
        4.2.6 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体质量检测
        4.2.7 sTNFRⅡ-Fc过表达慢病毒载体滴度检测
    4.3 STNFRⅡ-MSC稳定细胞株的构建
        4.3.1 筛选sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株的puro最佳浓度
        4.3.2 sTNFRⅡ-Fc慢病毒转染UC-MSC的最佳转染条件
        4.3.3 sTNFRⅡ-MSC单克隆稳定细胞株的筛选
        4.3.4 sTNFRⅡ-MSC稳定细胞株纯度检测
    4.4 STNFRⅡ-MSC体外功能特性的确定
        4.4.1 sTNFRⅡ-MSC分泌sTNFRⅡ-Fc的水平
        4.4.2 sTNFRⅡ-MSC表面分子标记物检测
        4.4.3 sTNFRⅡ-MSC分化能力检测
        4.4.4 sTNFRⅡ-MSC条件培养液对UC-MSC中ICAM-1和VCAM-1表达的影响
        4.4.5 TNF-α和 IL-1β对 sTNFRⅡ-MSC中 ICAM-1和VCAM-1 表达的影响
        4.4.6 sTNFRⅡ-MSC和 FLS共培养体系中RANKL和 OPG的水平
    4.5 STNFRⅡ-MSC体内功能特性的确定
    4.6 细胞存活率检测
    4.7 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠整体指标的影响
        4.7.1 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠体重的影响
        4.7.2 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠关节炎指数和关节肿胀数的影响
    4.8 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏病理的影响
    4.9 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠踝关节病理的影响
    4.10 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠免疫学指标的影响
        4.10.1 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠胸腺和脾脏指数的影响
        4.10.2 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠胸腺T细胞和脾脏B细胞增殖的影响
        4.10.3 sTNFRⅡ-MSC对 CCⅡ特异的CD4+T 细胞增殖的影响
        4.10.4 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏Th1、Th2、Th17、Treg和Tfh细胞亚群的影响
        4.10.5 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏浆细胞和Breg细胞亚群的影响
        4.10.6 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-4和IL-10水平的影响
        4.10.7 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠血清IgG1、IgG2a和抗CCⅡ抗体水平的影响
    4.11 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠踝关节软骨MMP-13、TIMP-1、ADAMTS-5和CollagenⅡ表达的影响
    4.12 STNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠踝关节滑膜组织中MMP-13、TIMP-1和ADAMTS-5 表达的影响
    4.13 sTNFRⅡ-MSC对 CIA小鼠脾脏CD4+T 细胞相关转录因子表达的影响
    4.14 STNFRⅡ-MSC在不同病程CIA小鼠脾脏组织中的分布情况
    4.15 STNFRⅡ-MSC在不同病程CIA小鼠踝关节组织中的分布情况
    4.16 迁移至CIA小鼠脾脏组织中的STNFRⅡ-MSC上 LC3B-Ⅱ和Cleaved caspase3 的表达情况
    4.17 TNF-α对 STNFRⅡ-MSC功能的影响
        4.17.1 TNF-α对 sTNFRⅡ-MSC凋亡和自噬的影响
        4.17.2 TNF-α对 sTNFRⅡ-MSC成软骨功能的影响
5 讨论
6 结论
7 课题创新点
8 下一步计划
参考文献
附录
致谢
综述:间充质干细胞通过调控记忆T细胞治疗类风湿关节炎的研究进展
    参考文献



本文编号：3465002