流体剪切应力通过ERK5信号通路抑制RAW264.7细胞的破骨细胞分化
发布时间：2021-10-30 01:10
目的:研究流体剪切力（Fluid shear stress,FSS）通过调控RAW264.7细胞中的细胞外信号调节激酶5（extracellular-regulated kinase 5,ERK5）信号通路对其向破骨细胞分化及骨吸收功能的影响。方法:设置时间梯度对RAW264.7细胞加载0、15、30、45、60、90min的FSS,通过Western blot检测FSS对ERK5的作用及最佳作用时间,并验证XMD8-92对ERK5磷酸化的抑制作用;然后将实验分组为空白对照组、RANKL组、FSS组及FSS+RANKL组,处理4天后观察并检测破骨细胞分化、骨吸收功能及TRAP酶活性;通过使用CCK-8测定法检测细胞活力;使用Western blot法检测并分析磷酸化ERK5（p-ERK5）、NFATc1、CTSK、TRAP、MMP-9蛋白的表达。结果:Western blot检测显示RANKL对ERK5均无明显磷酸化激活作用,但加载FSS 30min对ERK5有显著激活作用,XMD8-92可特异性抑制FSS激活的ERK5磷酸化;细胞计数、TRAP酶活性及骨吸收实验显示,与RANKL组相...
【文章来源】：兰州大学甘肃省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
FSS可激活ERK5,但RANKL无明显激活注:定量分析pERK/ERK5的比值，图中数据显
兰州大学硕士学位论文流体剪切应力通过ERK5信号通路抑制RAW264.7细胞的破骨细胞分化163.1.2XMD9-92可抑制FSS可激活的ERK5磷酸化作用FSS对ERK5有直接激活作用,为了验证XMD8-92对FSS激活的ERK5的磷酸化是否有抑制作用，将实验分为空白对照组FSS组XMD8-92组和FSS+XMD8-92组,FSS+XMD8-92组在加载FSS之前先加入ERK5特异性抑制剂XMD8-92处理（根据前期实验，3μMXMD8-92对RAW264.7细胞中ERK5的抑制效果最佳）,实验完成立即提取蛋白并通过Westernblot检测蛋白表达,结果显示XMD8-92可特异性抑制FSS激活的ERK5磷酸化(图1,p<0.001)图2XMD8-92可抑制FSS激活的ERK5磷酸化作用注:定量分析pERK/ERK5比值，图中数据显示为平均值±标准差,n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.2加载FSS对破骨细胞分化及功能的影响3.2.1加载FSS后观察对破骨细胞分化的影响RAW264.7细胞在有或没有加RANKL的情况下加载FSS(12dyn/cm2,30min/day)处理4天后染色并进行TRAP酶活性检测，观察TRAP染色阳性细胞及540nm吸光度下TRAP酶活性，发现与RANKL组相比,RANKL+FSS组的TRAP阳性多核细胞显着减少，且单加FSS组的TRAP染色阳性细胞更少，与空白组无明显差异（图3A，B，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）；FSS组的TRAP酶活性与RANKL组比较也显著降低，且FSS+RANKL组的TRAP酶活性对比单加RANKL组降低（图3C，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001），结果显示FSS对RANKL激活的破骨细胞分化作用及TRAP酶活性有明显的抑制效果
兰州大学硕士学位论文流体剪切应力通过ERK5信号通路抑制RAW264.7细胞的破骨细胞分化17图3FSS可抑制RANKL诱导的破骨细胞分化注：（A，B，C）将RAW264.7细胞加或不加RANKL预处理并随后加载FSS(12dyn/cm2,30min/day)4天,然后进行TRAP染色并通过ImageJ计数TRAP阳性多核细胞,在540nm处测量TRAP活性，图中数据显示为平均值±标准差,n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.2.2加载FSS后观察破骨细胞在骨片上的骨吸收作用FSS组的骨吸收明显低于RANKL组,并且FSS+RANKL组的结果显示FSS对RANKL激活的骨吸收作用同样具有明显的抑制效应（图4A，B，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）；用CCK-8法检测发现FSS对RAW264.7细胞无明显毒性作用,并不会影响细胞活力，实验中观察到有极少数量的细胞在加载FSS时流失,但对实验结果并没有实质性影响,可忽略不计(图4C)图4FSS可抑制破骨细胞骨吸收功能，但并不影响RAW264.7细胞的活力注:(A，B)通过使用ImageJ分析骨片吸收面积来分析不同分组间破骨细胞的骨吸收能力；(C)在吸光度450nm处测量细胞活力，图中数据显示为平均值±标准差,n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001
本文编号：3465746
【文章来源】：兰州大学甘肃省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
FSS可激活ERK5,但RANKL无明显激活注:定量分析pERK/ERK5的比值，图中数据显
兰州大学硕士学位论文流体剪切应力通过ERK5信号通路抑制RAW264.7细胞的破骨细胞分化163.1.2XMD9-92可抑制FSS可激活的ERK5磷酸化作用FSS对ERK5有直接激活作用,为了验证XMD8-92对FSS激活的ERK5的磷酸化是否有抑制作用，将实验分为空白对照组FSS组XMD8-92组和FSS+XMD8-92组,FSS+XMD8-92组在加载FSS之前先加入ERK5特异性抑制剂XMD8-92处理（根据前期实验，3μMXMD8-92对RAW264.7细胞中ERK5的抑制效果最佳）,实验完成立即提取蛋白并通过Westernblot检测蛋白表达,结果显示XMD8-92可特异性抑制FSS激活的ERK5磷酸化(图1,p<0.001)图2XMD8-92可抑制FSS激活的ERK5磷酸化作用注:定量分析pERK/ERK5比值，图中数据显示为平均值±标准差,n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.2加载FSS对破骨细胞分化及功能的影响3.2.1加载FSS后观察对破骨细胞分化的影响RAW264.7细胞在有或没有加RANKL的情况下加载FSS(12dyn/cm2,30min/day)处理4天后染色并进行TRAP酶活性检测，观察TRAP染色阳性细胞及540nm吸光度下TRAP酶活性，发现与RANKL组相比,RANKL+FSS组的TRAP阳性多核细胞显着减少，且单加FSS组的TRAP染色阳性细胞更少，与空白组无明显差异（图3A，B，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）；FSS组的TRAP酶活性与RANKL组比较也显著降低，且FSS+RANKL组的TRAP酶活性对比单加RANKL组降低（图3C，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001），结果显示FSS对RANKL激活的破骨细胞分化作用及TRAP酶活性有明显的抑制效果
兰州大学硕士学位论文流体剪切应力通过ERK5信号通路抑制RAW264.7细胞的破骨细胞分化17图3FSS可抑制RANKL诱导的破骨细胞分化注：（A，B，C）将RAW264.7细胞加或不加RANKL预处理并随后加载FSS(12dyn/cm2,30min/day)4天,然后进行TRAP染色并通过ImageJ计数TRAP阳性多核细胞,在540nm处测量TRAP活性，图中数据显示为平均值±标准差,n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.2.2加载FSS后观察破骨细胞在骨片上的骨吸收作用FSS组的骨吸收明显低于RANKL组,并且FSS+RANKL组的结果显示FSS对RANKL激活的骨吸收作用同样具有明显的抑制效应（图4A，B，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）；用CCK-8法检测发现FSS对RAW264.7细胞无明显毒性作用,并不会影响细胞活力，实验中观察到有极少数量的细胞在加载FSS时流失,但对实验结果并没有实质性影响,可忽略不计(图4C)图4FSS可抑制破骨细胞骨吸收功能，但并不影响RAW264.7细胞的活力注:(A，B)通过使用ImageJ分析骨片吸收面积来分析不同分组间破骨细胞的骨吸收能力；(C)在吸光度450nm处测量细胞活力，图中数据显示为平均值±标准差,n=3,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001
本文编号：3465746
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