广州市花都区2型糖尿病的circRNA差异表达谱筛选与功能预测分析
发布时间：2021-12-23 03:51
目的:本研究通过基因芯片技术探讨广州市花都区2型糖尿病外周血中circRNA的差异表达谱特征,并在人群中进一步验证circRNA表达水平与2型糖尿病发病之间的关联;通过分析表达差异的circRNA以及生化指标与2型糖尿病之间的相关性,探讨表达差异的circRNA作为2型糖尿病生物标志物的可能性;最后预测差异表达circRNA在2型糖尿病发病过程中的功能机制,为2型糖尿病的预防治疗提供依据。方法:本研究依据2019年1月至10月份广州市花都区18周岁以上居民的现场调查。采用个体匹配的病例对照研究设计,共纳入了107名2型糖尿病患者与以性别相同,年龄差±5岁为匹配条件筛选的107名健康参照者为研究对象。第一阶段收集4名2型糖尿病患者与4名健康参照组的外周血,通过circRNA基因芯片技术筛选两组间circRNA差异表达谱。第二阶段收集103名2型糖尿病与103名健康参照者的全血样本以及人口学、实验室检查等信息。circRNA差异表达谱中筛选的4个circRNA通过实时荧光定量PCR技术进行定量检测,采用受试者工作曲线（ROC曲线）评价目标circRNA在2型糖尿病中的诊断价值,采用多因素条...
【文章来源】：广东药科大学广东省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
研究样本流程图
广东药科大学硕士研究生学位论文13（4）芯片扫描与结果分析：对玻片清洗、固定后使用AgilentScannerG2505C进行扫描，扫描后的图像通过软件AgilentFeatureExtraction11.0.1.1中获得荧光信号等原始数据，再使用R软件归一化处理，通过使用R软件ggplot2包绘制火山图，分析病例组与对照组在circRNA表达水平上的一致性，病例组与对照组表达差异的circRNA通过变化倍数与P值进行筛选，选取变化倍数（foldchangeFC）不低于1.5倍即|FC|≥1.5，t检验以P<0.05作为阳性结果。circRNA芯片实验由上海康成生物有限公司协助完成。2.6实时荧光定量PCR反应（qPCR）法验证差异表达的circRNA2.6.1实时荧光定量PCR检测circRNA的原理实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR,qPCR）是一种在模板DNA发生指数型扩增的反应中，通过荧光染料或者化合物等材料测定每次循环后目标产物总量的方法，根据荧光化合物的不同，可以分为TaqMan荧光探针方法与SYBRGreenⅠ染料试剂法进行检测。本实验中使用SYBRGreenⅠ染料试剂法，该方法是在扩增反应体系中引入了过量的SYBR荧光染料剂，这些染料能特异性地结合到DNA双链后产生荧光信号，而没有结合到DNA双链的SYBR荧光染料不会产生荧光信号，通过分析每个循环扩增产物的荧光信号强度、阈值（Ct）和溶解曲线，可对目的基因相对表达量进行测定。图2-2实时荧光定量PCR检测circRNA的原理示意图
广东药科大学硕士研究生学位论文22表3-2RNA定量与质量检测结果SampleIDA260/280A260/230Conc(ng/ul)Volume(ul)Quantity(ng)QCresult(passorfail)T2DM11.941.81548.65158229.75passT2DM21.891.80259.05153885.75passT2DM32.002.27238.34153575.1passT2DM42.092.23270.13154051.95passNGT11.901.90261.88153928.20passNGT21.872.06270.69154060.35passNGT31.982.24156.02152340.34passNGT42.002.30249.79153746.81pass注：T2DM1、T2DM2、T2DM3、T2DM4为糖尿病组，NGT1、NGT2、NGT3、NGT4分别为配对的对照组图3-1RNA琼脂糖凝胶电泳（左图为糖尿病组，右图为对照组）3.1.3火山图与散点图circRNA芯片数据结果经过归一化处理后，使用散点图能反应糖尿病组与对照组中circRNA的总体分布趋势，同时可以评估两组样本中circRNA表达的差异性。以对照组的circRNA平均表达量进行log2对数转换的信号值为横坐标，以糖尿病组的circRNA平均表达量进行log2对数转换的信号值为纵坐标建立散点图（图3-2），图中在line1绿色线上方与line2绿色线下方为变化倍数|FC|≥1.5，P<0.05的显著表达差异circRNA，其中line1线上方为表达上调的circRNA，line2线下方为表达下调的circRNA。火山图能将circRNA芯片结果中基因的数量、差异的显著性与可靠性进行可视化，本实验中根据变化倍数FC与P值作图，以横坐标为log2(FC)，纵坐标为-log10(P值)建立火山图（图3-3），图中水平绿色线以上与两条竖直绿色线以外的
本文编号：3547723
【文章来源】：广东药科大学广东省
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
研究样本流程图
广东药科大学硕士研究生学位论文13（4）芯片扫描与结果分析：对玻片清洗、固定后使用AgilentScannerG2505C进行扫描，扫描后的图像通过软件AgilentFeatureExtraction11.0.1.1中获得荧光信号等原始数据，再使用R软件归一化处理，通过使用R软件ggplot2包绘制火山图，分析病例组与对照组在circRNA表达水平上的一致性，病例组与对照组表达差异的circRNA通过变化倍数与P值进行筛选，选取变化倍数（foldchangeFC）不低于1.5倍即|FC|≥1.5，t检验以P<0.05作为阳性结果。circRNA芯片实验由上海康成生物有限公司协助完成。2.6实时荧光定量PCR反应（qPCR）法验证差异表达的circRNA2.6.1实时荧光定量PCR检测circRNA的原理实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR,qPCR）是一种在模板DNA发生指数型扩增的反应中，通过荧光染料或者化合物等材料测定每次循环后目标产物总量的方法，根据荧光化合物的不同，可以分为TaqMan荧光探针方法与SYBRGreenⅠ染料试剂法进行检测。本实验中使用SYBRGreenⅠ染料试剂法，该方法是在扩增反应体系中引入了过量的SYBR荧光染料剂，这些染料能特异性地结合到DNA双链后产生荧光信号，而没有结合到DNA双链的SYBR荧光染料不会产生荧光信号，通过分析每个循环扩增产物的荧光信号强度、阈值（Ct）和溶解曲线，可对目的基因相对表达量进行测定。图2-2实时荧光定量PCR检测circRNA的原理示意图
广东药科大学硕士研究生学位论文22表3-2RNA定量与质量检测结果SampleIDA260/280A260/230Conc(ng/ul)Volume(ul)Quantity(ng)QCresult(passorfail)T2DM11.941.81548.65158229.75passT2DM21.891.80259.05153885.75passT2DM32.002.27238.34153575.1passT2DM42.092.23270.13154051.95passNGT11.901.90261.88153928.20passNGT21.872.06270.69154060.35passNGT31.982.24156.02152340.34passNGT42.002.30249.79153746.81pass注：T2DM1、T2DM2、T2DM3、T2DM4为糖尿病组，NGT1、NGT2、NGT3、NGT4分别为配对的对照组图3-1RNA琼脂糖凝胶电泳（左图为糖尿病组，右图为对照组）3.1.3火山图与散点图circRNA芯片数据结果经过归一化处理后，使用散点图能反应糖尿病组与对照组中circRNA的总体分布趋势，同时可以评估两组样本中circRNA表达的差异性。以对照组的circRNA平均表达量进行log2对数转换的信号值为横坐标，以糖尿病组的circRNA平均表达量进行log2对数转换的信号值为纵坐标建立散点图（图3-2），图中在line1绿色线上方与line2绿色线下方为变化倍数|FC|≥1.5，P<0.05的显著表达差异circRNA，其中line1线上方为表达上调的circRNA，line2线下方为表达下调的circRNA。火山图能将circRNA芯片结果中基因的数量、差异的显著性与可靠性进行可视化，本实验中根据变化倍数FC与P值作图，以横坐标为log2(FC)，纵坐标为-log10(P值)建立火山图（图3-3），图中水平绿色线以上与两条竖直绿色线以外的
本文编号：3547723
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