茶黄素在HepG2细胞和2型糖尿病小鼠模型中改善胰岛素抵抗及其分子机制研究
发布时间：2022-01-07 11:13
红茶是全球消费量最大的茶类,茶黄素是红茶中多酚氧化聚合形成的一类具有苯骈卓酚酮结构化合物的总称,在体内外具有多种生物学功能。本研究采用软脂酸（PA）诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞模型,以及高脂饲料联合链脲佐菌素（STZ）诱导的2型糖尿病C57BL/6小鼠模型,研究了茶黄素对高脂诱导胰岛素抵抗的作用及相关机制,进而采用转录组学测序技术,分析了茶黄素对糖尿病小鼠肝脏的分子信号调控网络。主要研究结果如下:1.采用Western Blot法分析证实,茶黄素通过上调葡萄糖转运蛋白GLUT4的蛋白表达,增加Akt在Ser473的磷酸化水平和减少IRS-1在Ser307的磷酸化来水平,显著增加胰岛素抵抗HepG2细胞的葡萄糖摄取。此外,通过荧光定量PCR法,茶黄素增加了线粒体DNA的相对含量,下调PGC-1βmRNA水平并增加PRC mRNA水平。Mdivi-1是一种选择性的线粒体分裂抑制剂,可以减弱TFs诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞摄取葡萄糖的促进作用。这些结果表明茶黄素可以改善由PA诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗,至少部分地通过促进线粒体的生物合成的途径。2.在高脂联合STZ诱导2型糖尿病模型...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
四种主要茶黄素的结构图
浙江大学硕士学位论文第一章绪论8以125mg/kg剂量注射STZ，继续喂养4周后成模。喂养过程中发现小鼠的血糖升高缓慢，体重、摄食量与饮水量与对照组无显著差异，直至造模结束后表现为高血糖，代谢变化过程缓慢，能较好的模拟人2型糖尿病的形成。1.5研究内容及技术路线目前关于红茶改善胰岛素抗性的研究较少，在链脲霉素结合高脂诱导的2型糖尿病小鼠模型中，红茶和绿茶提取物均能降低血糖，改善葡萄糖耐受不良，但红茶提取物显著提高血清胰岛素水平，而绿茶不能，表明红茶和绿茶改善胰岛素抵抗的作用机理不同[53]。上述研究均采用红茶茶汤或提取物进行研究，未能排除样品中儿茶素等多酚类物质和咖啡因的干扰。基于上述实验结果，本论文拟采用软脂酸PA诱导的人HepG2细胞胰岛素抵抗模型和高脂与链脲霉素联合诱导的2型糖尿病小鼠模型，以高纯度的茶黄素TFs为供试样品，结合转录组学，从动物、细胞以及分子水平研究茶黄素对线粒体生物合成和功能以及胰岛素抗性的作用和机制。图1.2研究技术路线图Fig1.2Theresearchroadmapofthepresentstudy
浙江大学硕士学位论文第二章茶黄素在HepG2细胞模型中通过线粒体途径改善软脂酸诱导的胰岛素抵抗14封闭：弃蒸馏水，加入含5%脱脂奶粉的TBST封闭液约10mL，室温摇床孵育1h。一抗孵育：按说明书用稀释液稀释一抗，置于4oC孵育2h。在摇床上用TBST漂洗NC膜30min，每十分钟换一次TBST液，除去多余一抗。二抗孵育：弃TBST液，加入用稀释液稀释的二抗10mL，室温摇床孵育2h。在摇床上用TBST漂洗NC膜30min，每十分钟换一次TBST液，除去多余二抗。ECL法显影：加入新鲜配制的化学发光液，摇床孵育5min后用凝胶成像分析系统成像、拍照、分析。GAPDH为本实验的内参蛋白。2.2.2.10统计方法实验数据用平均数±标准偏差（mean±SD）表示，使用GraphPadPrism软件进行统计学分析，Origin软件作图。采用单因素方差分析（ANOVA）、Dunnett’s多重检验法分析显著性差异，p<0.05时判定有显著差异性。2.3结果与分析2.3.1茶黄素含量的分析和鉴定HPLC分析结果表明，本实验中所用的TFs分别为12.0%TF、18.1%TF2A、24.1%TF2B和38.49%TF3。四种茶黄素单体的总含量为92.8%(图2.1)。图2.1茶黄素的HPLC色谱分析。1，茶黄素(TF)：R1=R2=H；2，茶黄素-3-没食子酸酯(TF2A)：R1=H，R2=galloyl；3，茶黄素-3′-没食子酸酯(TF2B)：R1=galloyl，R2=H；4.茶黄素-3，3′-丁二酸(TF3)：R1=R2=galloyl。Figure2.1HPLCchromatogramoftheaflavins(TFs).1,Theaflavin(TF):R1=R2=H;2,Theaflavin-3-gallate(TF2A):R1=H,R2=galloyl;3,Theaflavin-3′-gallate(TF2B):R1=galloyl,R2=H;4.Theaflavins-3,3′-digallate(TF3):
【参考文献】：
期刊论文
[1]茶叶降血糖活性及对糖尿病的功效与机理[J]. 江和源. 中国茶叶. 2019(02)
[2]茶黄素的理化性质·提取分离及生物活性研究进展[J]. 丁其欢,字成庭,周增志,吕才有. 安徽农业科学. 2017(11)
[3]2型糖尿病鼠类模型的研究进展[J]. 高秀莹,周迎生. 中国实验动物学报. 2014(04)
[4]茶黄素提取物及茶黄素片的急性毒性[J]. 张建勇,江和源,王岩,刘东英. 中国农学通报. 2014(21)
[5]二醇基键合硅胶制备色谱分离纯化茶黄素类及其稳定性[J]. 谢练武,郭亚平,方继前,周春山. 食品科学. 2012(21)
[6]茶黄素抑菌作用的研究[J]. 金恩惠,吴媛媛,屠幼英. 中国食品学报. 2011(06)
[7]高脂饮食加低剂量链脲霉素建立小鼠2型糖尿病模型[J]. 姜骊,陈辉,何勇,鱼达. 中国比较医学杂志. 2010(03)
[8]不同处理方式对4个来源C57BL/6J小鼠血糖变化的影响[J]. 牛屹东,张孟蕾,梁蜀龙. 西南师范大学学报(自然科学版). 2010(01)
[9]高速逆流色谱法分离茶黄素条件的优化[J]. 王坤波,刘仲华,黄建安,刘芳,龚雨顺,潘宇,黄浩. 食品科学. 2009(06)
[10]影响实验动物脏器重量及脏器系数因素分析[J]. 孙建新,安娟,连军. 实验动物科学. 2009(01)
博士论文
[1]从肠道黏膜屏障与免疫系统探讨小檗碱改善糖脂代谢紊乱的机制[D]. 巩静.华中科技大学 2018
[2]茶黄素的UPLC分析及其对人卵巢癌细胞抑制作用和机制的研究[D]. 潘海波.浙江大学 2018
本文编号：3574436
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
四种主要茶黄素的结构图
浙江大学硕士学位论文第一章绪论8以125mg/kg剂量注射STZ，继续喂养4周后成模。喂养过程中发现小鼠的血糖升高缓慢，体重、摄食量与饮水量与对照组无显著差异，直至造模结束后表现为高血糖，代谢变化过程缓慢，能较好的模拟人2型糖尿病的形成。1.5研究内容及技术路线目前关于红茶改善胰岛素抗性的研究较少，在链脲霉素结合高脂诱导的2型糖尿病小鼠模型中，红茶和绿茶提取物均能降低血糖，改善葡萄糖耐受不良，但红茶提取物显著提高血清胰岛素水平，而绿茶不能，表明红茶和绿茶改善胰岛素抵抗的作用机理不同[53]。上述研究均采用红茶茶汤或提取物进行研究，未能排除样品中儿茶素等多酚类物质和咖啡因的干扰。基于上述实验结果，本论文拟采用软脂酸PA诱导的人HepG2细胞胰岛素抵抗模型和高脂与链脲霉素联合诱导的2型糖尿病小鼠模型，以高纯度的茶黄素TFs为供试样品，结合转录组学，从动物、细胞以及分子水平研究茶黄素对线粒体生物合成和功能以及胰岛素抗性的作用和机制。图1.2研究技术路线图Fig1.2Theresearchroadmapofthepresentstudy
浙江大学硕士学位论文第二章茶黄素在HepG2细胞模型中通过线粒体途径改善软脂酸诱导的胰岛素抵抗14封闭：弃蒸馏水，加入含5%脱脂奶粉的TBST封闭液约10mL，室温摇床孵育1h。一抗孵育：按说明书用稀释液稀释一抗，置于4oC孵育2h。在摇床上用TBST漂洗NC膜30min，每十分钟换一次TBST液，除去多余一抗。二抗孵育：弃TBST液，加入用稀释液稀释的二抗10mL，室温摇床孵育2h。在摇床上用TBST漂洗NC膜30min，每十分钟换一次TBST液，除去多余二抗。ECL法显影：加入新鲜配制的化学发光液，摇床孵育5min后用凝胶成像分析系统成像、拍照、分析。GAPDH为本实验的内参蛋白。2.2.2.10统计方法实验数据用平均数±标准偏差（mean±SD）表示，使用GraphPadPrism软件进行统计学分析，Origin软件作图。采用单因素方差分析（ANOVA）、Dunnett’s多重检验法分析显著性差异，p<0.05时判定有显著差异性。2.3结果与分析2.3.1茶黄素含量的分析和鉴定HPLC分析结果表明，本实验中所用的TFs分别为12.0%TF、18.1%TF2A、24.1%TF2B和38.49%TF3。四种茶黄素单体的总含量为92.8%(图2.1)。图2.1茶黄素的HPLC色谱分析。1，茶黄素(TF)：R1=R2=H；2，茶黄素-3-没食子酸酯(TF2A)：R1=H，R2=galloyl；3，茶黄素-3′-没食子酸酯(TF2B)：R1=galloyl，R2=H；4.茶黄素-3，3′-丁二酸(TF3)：R1=R2=galloyl。Figure2.1HPLCchromatogramoftheaflavins(TFs).1,Theaflavin(TF):R1=R2=H;2,Theaflavin-3-gallate(TF2A):R1=H,R2=galloyl;3,Theaflavin-3′-gallate(TF2B):R1=galloyl,R2=H;4.Theaflavins-3,3′-digallate(TF3):
【参考文献】：
期刊论文
[1]茶叶降血糖活性及对糖尿病的功效与机理[J]. 江和源. 中国茶叶. 2019(02)
[2]茶黄素的理化性质·提取分离及生物活性研究进展[J]. 丁其欢,字成庭,周增志,吕才有. 安徽农业科学. 2017(11)
[3]2型糖尿病鼠类模型的研究进展[J]. 高秀莹,周迎生. 中国实验动物学报. 2014(04)
[4]茶黄素提取物及茶黄素片的急性毒性[J]. 张建勇,江和源,王岩,刘东英. 中国农学通报. 2014(21)
[5]二醇基键合硅胶制备色谱分离纯化茶黄素类及其稳定性[J]. 谢练武,郭亚平,方继前,周春山. 食品科学. 2012(21)
[6]茶黄素抑菌作用的研究[J]. 金恩惠,吴媛媛,屠幼英. 中国食品学报. 2011(06)
[7]高脂饮食加低剂量链脲霉素建立小鼠2型糖尿病模型[J]. 姜骊,陈辉,何勇,鱼达. 中国比较医学杂志. 2010(03)
[8]不同处理方式对4个来源C57BL/6J小鼠血糖变化的影响[J]. 牛屹东,张孟蕾,梁蜀龙. 西南师范大学学报(自然科学版). 2010(01)
[9]高速逆流色谱法分离茶黄素条件的优化[J]. 王坤波,刘仲华,黄建安,刘芳,龚雨顺,潘宇,黄浩. 食品科学. 2009(06)
[10]影响实验动物脏器重量及脏器系数因素分析[J]. 孙建新,安娟,连军. 实验动物科学. 2009(01)
博士论文
[1]从肠道黏膜屏障与免疫系统探讨小檗碱改善糖脂代谢紊乱的机制[D]. 巩静.华中科技大学 2018
[2]茶黄素的UPLC分析及其对人卵巢癌细胞抑制作用和机制的研究[D]. 潘海波.浙江大学 2018
本文编号：3574436
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