钙/钙调蛋白依赖的丝氨酸激酶参与糖尿病大鼠外周神经病理性疼痛的分子机制研究

发布时间：2022-10-06 10:16

　　目的CASK即钙/钙调蛋白依赖的丝氨酸激酶,是一种多功能蛋白。据文献报道,CASK主要存在于中枢神经系统,且在膜蛋白跨膜运输和胞吐过程中扮演着重要角色,目前CASK在神经病理性疼痛中所起的作用尚不太清楚。本研究旨在探讨CASK在糖尿病性神经病理性疼痛中对嘌呤能受体表达的作用。方法1.在180-200 g雄性SD大鼠腹腔一次性注射STZ诱导糖尿病性神经病理性疼痛模型。2.足底注射荧光素（Di I）逆行标记足底组织特异性脊髓背根神经节（DRG）神经元胞体。3.运用Western Blotting检测CASK及嘌呤能受体在足底组织特异性DRG（L4-L6）中的表达水平。4.运用后足撤回反射评测正常大鼠和糖尿病大鼠对机械刺激和热刺激的行为反应。结果1.行为学显示,糖尿病大鼠造模两周后有显著的痛觉过敏现象,表现为机械痛痛阈行为学评分和热痛痛阈行为学评分异常;2.与对照组比较,DM大鼠足底组织特异性DRG中CASK及P2X2（嘌呤能受体,配体门控阳离子通道,2）受体表达水平显著升高;3.鞘内注射CASK的慢病毒能够显著降低ATP（三磷酸腺苷）电流密度和P2X2受体的表达;4.鞘内注射CASK的慢病... 

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
第一章 引言
第二章 材料与方法
    2.1 实验对象
    2.2 糖尿病（Diabetics Mellitus，DM）大鼠模型的建立
        2.2.1 实验用药
        2.2.2 造模方法
    2.3 机械痛阈检测
        2.3.1 实验仪器
        2.3.2 实验用药
        2.3.3 测试方法
    2.4 热痛阈检测
        2.4.1 实验仪器
        2.4.2 实验用药
        2.4.3 测试方法
    2.5 运动功能测试（Rotarod test）
        2.5.1 实验仪器
        2.5.2 实验内容
    2.6 组织特异性DRG神经元的标记、急性分离与培养
        2.6.1 实验仪器
        2.6.2 实验试剂
        2.6.3 荧光染料DiI标记足底相关DRG神经元
        2.6.4 DRG神经元的急性分离
    2.7 全细胞膜片钳实验
        2.7.1 实验仪器
        2.7.2 实验试剂及药品
        2.7.3 拉制玻璃微电极
        2.7.4 全细胞膜片钳记录
        2.7.5 神经元兴奋性记录
        2.7.6 数据分析
    2.8 细胞培养
        2.8.1 实验试剂
        2.8.2 实验仪器
        2.8.3 DMEM培养基的配置
        2.8.4 细胞系/株的培养
        2.8.5 慢病毒包装及细胞转染
        2.8.6 细胞成像
    2.9 Western Blotting检测蛋白表达
        2.9.1 实验试剂
        2.9.2 实验仪器
        2.9.3 实验方法
    2.10 qRT-PCR检测目的基因mRNA含量
        2.10.1 总RNA的提取
        2.10.2 cDNA的合成
        2.10.3 实时定量PCR
        2.10.4 实时定量PCR数据分析
    2.11 免疫细胞化学
        2.11.1 实验试剂
        2.11.2 实验仪器
        2.11.3 实验方法
    2.12 免疫共沉淀
        2.12.1 实验试剂
        2.12.2 实验仪器
        2.12.3 实验方法
        2.12.4 注意事项
第三章 实验结果
    3.1 CASK/嘌呤能受体信号转导途径参与DM大鼠的足底痛觉过敏的形成
        3.1.1 腹腔注射STZ诱导成年大鼠痛觉行为学评分显著降低
        3.1.2 CASK基因在DM组大鼠DRG中转录、表达水平显著增强
        3.1.3 P2X2基因在DM组大鼠DRG中表达水平显著增强
        3.1.4 CASK shRNA和CASK scrRNA的感染效率无明显差异
        3.1.5 CASK shRNA显著降低DM大鼠足底特异性DRG神经元ATP电流密度
        3.1.6 CASK shRNA显著反转P2X2基因在DM组大鼠DRG中表达水平
        3.1.7 CASK 和嘌呤能受体之间的相互作用
        3.1.8 CASK shRNA显著升高了DM大鼠的痛觉行为学评分
第四章 讨论
    4.1 CASK的辅转录因子作用
    4.2 CASK的蛋白激酶功能
    4.3 CASK的支架蛋白功能
第五章 结论
参考文献
Review
    References
致谢



本文编号：3686794