cGAS-STING通路介导百草枯中毒急性肺损伤的作用机制研究及熊果酸的治疗作用
发布时间：2023-02-14 21:17
目的:百草枯(PQ)是一种高效、廉价的除草剂,与土壤接触后可迅速失活,植物体内很少残留,如能正常使用,则安全性高,且环境污染少,有利于可持续农业的发展。然而,因偶然摄入或蓄意自杀所致的PQ中毒事件,在临床上却屡见不鲜,在世界范围内口服农药自杀事件中也非常常见,且致死率很高,严重中毒后存活率不足50%。由于其中毒机制迄今不明,没有特效解毒剂,其中毒后给人们带来的危害不可忽视。PQ中毒可导致多种器官功能障碍,且以肺损伤最为严重,中毒早期以急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征为主要表现,也是中毒早期主要的死亡原因。目前研究认为,氧化损伤及免疫炎症反应在PQ中毒发病过程中的作用不可估量,但具体分子机制不明。PQ中毒可以引起细胞DNA损伤。正常情况下,在真核细胞中,只有细胞核和线粒体中存在DNA,它是遗传信息的载体,对维持机体生命活动至关重要。当组织细胞损伤时导致遗传物质外漏,易位的self-DNA异常增多,可以作为损伤相关分子模式(DAMPs)而存在,是诱发免疫炎症反应的重要原因,也是导致肺部炎症损伤的重要因素。线粒体DNA(mtDNA)是self-DNA的重要成员之一,其在PQ中毒发病机制中的重要...
【文章页数】：97 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 :STING-IRF3信号通路介导百草枯中毒急性肺损伤
1 前言
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.2 实验动物
2.3 动物模型建立及分组
2.4 HE染色及肺损伤病理评分
2.4.1 HE染色
2.4.2 肺损伤病理评分
2.5 肺脏湿重/干重(W/D)比值
2.6 小鼠肺组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定
2.6.1 MDA检测(硫代巴比妥酸反应法)
2.6.2 SOD检测(黄嘌呤氧化酶法)
2.7 细胞培养
2.8 细胞活性检测
2.9 细胞转染
2.10 逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
2.10.1 RNA提取
2.10.2 cDNA合成
2.10.3 Real-time PCR
2.11 免疫印迹实验(Western blot实验)
2.11.1 样本蛋白的提取
2.11.2 蛋白浓度测定(BCA法)
2.11.3 SDS-PAGE凝胶制备
2.11.4 电泳
2.11.5 转膜
2.11.6 抗原抗体反应
2.11.7 化学发光及结果分析
2.12 免疫组化实验
2.12.1 石蜡切片的制作
2.12.2 抗原修复
2.12.3 抗原抗体反应
2.12.4 显色反应
2.12.5 封片及图像采集
2.13 免疫荧光染色
2.13.1 细胞固定
2.13.2 细胞膜通透及抗原封闭
2.13.3 抗原抗体反应
2.13.4 DAPI染色
2.13.5 封片及图像采集
2.14 酶联免疫吸附试验(ELISA)
2.14.1 标本采集
2.14.2 ELISA
2.15 统计分析
3 结果
3.1 小鼠肺组织病理变化及W/D比值
3.2 小鼠肺组织MDA及SOD的表达变化
3.3 小鼠肺组织中Sting、Irf3和IfnβmRNA表达水平的变化
3.4 小鼠肺组织中STING及 IRF3的表达分布情况
3.5 小鼠肺组织中STING和 IRF3(p IRF3)蛋白表达水平的变化
3.6 小鼠血清中IFNβ表达水平的变化
3.7 RAW264.7小鼠巨噬细胞的活性
3.8 RAW264.7小鼠巨噬细胞中STING和 IRF3的表达分布
3.9 STING在PQ诱导IFNβ表达过程中的作用
3.10 IRF3在PQ诱导IFNβ表达过程中的作用
4 讨论
5 结论
第二部分 :TBK1参与调节STING-IRF3通路介导的百草枯中毒小鼠急性肺损伤
1 前言
2 实验材料及方法
2.1 材料及主要仪器设备
2.2 实验动物
2.3 动物分组
2.4 HE染色及肺损伤病理评分
2.5 肺泡灌洗液蛋白浓度测定
2.6 细胞培养
2.7 细胞模型的药物处理浓度筛选及细胞分组
2.7.1 细胞模型的药物处理浓度筛选
2.7.2 细胞分组
2.8 肺组织及RAW264.7细胞中的活性氧(ROS)水平检测
2.8.1 肺组织ROS水平检测
2.8.2 RAW264.7细胞中ROS水平检测
2.9 免疫组化实验
2.9.1 组织免疫组化实验
2.9.2 细胞免疫组化实验
2.10 Western blot实验
2.10.1 细胞核蛋白及细胞浆蛋白分离
2.10.2 BCA法测蛋白浓度并标准化
2.10.3 Western blot实验
2.11 RT-q PCR实验
2.12 ELISA实验
2.13 统计方法
3 实验结果
3.1 肺组织病理改变及肺泡灌洗液蛋白浓度
3.2 药物处理RAW264.7细胞的浓度筛选
3.3 肺组织ROS及炎性因子表达水平的变化
3.4 RAW264.7细胞ROS及炎性因子表达水平的变化
3.5 肺组织中NF-κBp65和IRF3的表达分布
3.6 RAW264.7细胞中NF-κBp65和IRF3的表达分布
3.7 肺组织及RAW264.7细胞的胞浆蛋白中TBK1、pTBK1的表达
3.8 肺组织及RAW264.7细胞的胞浆蛋白内STING的表达变化
4 讨论
5 结论
第三部分 :熊果酸通过抑制cGAS-STING通路缓解百草枯中毒小鼠急性肺损伤
1 前言
2 实验材料及方法
2.1 实验试剂
2.2 实验动物
2.3 动物分组
2.4 HE染色及肺损伤病理评分
2.5 肺脏湿重/干重(W/D)比值
2.6 细胞培养
2.7 CCK8实验及细胞分组
2.7.1 CCK8实验
2.7.2 细胞分组
2.8 DHE染色
2.8.1 组织DHE染色
2.8.2 细胞DHE染色
2.9 Real-time PCR实验检测mtDNA与nDNA
2.9.1 样本采集
2.9.2 样本DNA的提取
2.9.3 Real time-PCR实验
2.10 双链DNA(dsDNA)的检测
2.10.1 样本采集
2.10.2 dsDNA的检测
2.11 Western blot实验
2.12 ELISA实验
2.13 统计方法
3 实验结果
3.1 小鼠体重变化、肺组织病理改变和肺脏W/D比值
3.2 药物处理RAW264.7细胞的浓度筛选
3.3 小鼠肺组织和RAW264.7细胞的氧化损伤情况
3.4 小鼠肺泡灌洗液、血清及细胞培养上清液中dsDNA的表达
3.5 小鼠肺组织及RAW264.7细胞中c GAS的表达变化
3.6 小鼠肺组织及RAW264.7细胞中STING、TBK1(pTBK1)、IRF3(pIRF3)的表达变化
3.7 小鼠肺泡灌洗液、血清及细胞培养上清液中IFNβ的表达变化
4 讨论
5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简介
本文编号：3743043
【文章页数】：97 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 :STING-IRF3信号通路介导百草枯中毒急性肺损伤
1 前言
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器
2.2 实验动物
2.3 动物模型建立及分组
2.4 HE染色及肺损伤病理评分
2.4.1 HE染色
2.4.2 肺损伤病理评分
2.5 肺脏湿重/干重(W/D)比值
2.6 小鼠肺组织丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定
2.6.1 MDA检测(硫代巴比妥酸反应法)
2.6.2 SOD检测(黄嘌呤氧化酶法)
2.7 细胞培养
2.8 细胞活性检测
2.9 细胞转染
2.10 逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)
2.10.1 RNA提取
2.10.2 cDNA合成
2.10.3 Real-time PCR
2.11 免疫印迹实验(Western blot实验)
2.11.1 样本蛋白的提取
2.11.2 蛋白浓度测定(BCA法)
2.11.3 SDS-PAGE凝胶制备
2.11.4 电泳
2.11.5 转膜
2.11.6 抗原抗体反应
2.11.7 化学发光及结果分析
2.12 免疫组化实验
2.12.1 石蜡切片的制作
2.12.2 抗原修复
2.12.3 抗原抗体反应
2.12.4 显色反应
2.12.5 封片及图像采集
2.13 免疫荧光染色
2.13.1 细胞固定
2.13.2 细胞膜通透及抗原封闭
2.13.3 抗原抗体反应
2.13.4 DAPI染色
2.13.5 封片及图像采集
2.14 酶联免疫吸附试验(ELISA)
2.14.1 标本采集
2.14.2 ELISA
2.15 统计分析
3 结果
3.1 小鼠肺组织病理变化及W/D比值
3.2 小鼠肺组织MDA及SOD的表达变化
3.3 小鼠肺组织中Sting、Irf3和IfnβmRNA表达水平的变化
3.4 小鼠肺组织中STING及 IRF3的表达分布情况
3.5 小鼠肺组织中STING和 IRF3(p IRF3)蛋白表达水平的变化
3.6 小鼠血清中IFNβ表达水平的变化
3.7 RAW264.7小鼠巨噬细胞的活性
3.8 RAW264.7小鼠巨噬细胞中STING和 IRF3的表达分布
3.9 STING在PQ诱导IFNβ表达过程中的作用
3.10 IRF3在PQ诱导IFNβ表达过程中的作用
4 讨论
5 结论
第二部分 :TBK1参与调节STING-IRF3通路介导的百草枯中毒小鼠急性肺损伤
1 前言
2 实验材料及方法
2.1 材料及主要仪器设备
2.2 实验动物
2.3 动物分组
2.4 HE染色及肺损伤病理评分
2.5 肺泡灌洗液蛋白浓度测定
2.6 细胞培养
2.7 细胞模型的药物处理浓度筛选及细胞分组
2.7.1 细胞模型的药物处理浓度筛选
2.7.2 细胞分组
2.8 肺组织及RAW264.7细胞中的活性氧(ROS)水平检测
2.8.1 肺组织ROS水平检测
2.8.2 RAW264.7细胞中ROS水平检测
2.9 免疫组化实验
2.9.1 组织免疫组化实验
2.9.2 细胞免疫组化实验
2.10 Western blot实验
2.10.1 细胞核蛋白及细胞浆蛋白分离
2.10.2 BCA法测蛋白浓度并标准化
2.10.3 Western blot实验
2.11 RT-q PCR实验
2.12 ELISA实验
2.13 统计方法
3 实验结果
3.1 肺组织病理改变及肺泡灌洗液蛋白浓度
3.2 药物处理RAW264.7细胞的浓度筛选
3.3 肺组织ROS及炎性因子表达水平的变化
3.4 RAW264.7细胞ROS及炎性因子表达水平的变化
3.5 肺组织中NF-κBp65和IRF3的表达分布
3.6 RAW264.7细胞中NF-κBp65和IRF3的表达分布
3.7 肺组织及RAW264.7细胞的胞浆蛋白中TBK1、pTBK1的表达
3.8 肺组织及RAW264.7细胞的胞浆蛋白内STING的表达变化
4 讨论
5 结论
第三部分 :熊果酸通过抑制cGAS-STING通路缓解百草枯中毒小鼠急性肺损伤
1 前言
2 实验材料及方法
2.1 实验试剂
2.2 实验动物
2.3 动物分组
2.4 HE染色及肺损伤病理评分
2.5 肺脏湿重/干重(W/D)比值
2.6 细胞培养
2.7 CCK8实验及细胞分组
2.7.1 CCK8实验
2.7.2 细胞分组
2.8 DHE染色
2.8.1 组织DHE染色
2.8.2 细胞DHE染色
2.9 Real-time PCR实验检测mtDNA与nDNA
2.9.1 样本采集
2.9.2 样本DNA的提取
2.9.3 Real time-PCR实验
2.10 双链DNA(dsDNA)的检测
2.10.1 样本采集
2.10.2 dsDNA的检测
2.11 Western blot实验
2.12 ELISA实验
2.13 统计方法
3 实验结果
3.1 小鼠体重变化、肺组织病理改变和肺脏W/D比值
3.2 药物处理RAW264.7细胞的浓度筛选
3.3 小鼠肺组织和RAW264.7细胞的氧化损伤情况
3.4 小鼠肺泡灌洗液、血清及细胞培养上清液中dsDNA的表达
3.5 小鼠肺组织及RAW264.7细胞中c GAS的表达变化
3.6 小鼠肺组织及RAW264.7细胞中STING、TBK1(pTBK1)、IRF3(pIRF3)的表达变化
3.7 小鼠肺泡灌洗液、血清及细胞培养上清液中IFNβ的表达变化
4 讨论
5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简介
本文编号：3743043
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/nfm/3743043.html
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