粉尘螨V类变应原Der f5基因的表达及其特异性免疫治疗效果分析

发布时间：2023-03-23 19:27

　　目的:克隆粉尘螨Ⅴ类变应原Der f5基因并进行蛋白表达,分析其对哮喘小鼠特异性免疫治疗效果。方法:(1)已知der f5基因序列设计相应引物,提取粉尘螨总RNA,扩增der f5基因片段,RT-PCR法扩增后产物与克隆载体p UC57连接,转化入大肠杆菌DH-5α中,经酶切及测序鉴定获得p UC57-Der f5阳性菌株。提取质粒后用限制性内切酶NotⅠ和XhoⅠ进行双酶切,连接到原核表达载体p ET-28a(+)产生重组原核表达载体p ET28a(+)-Der f5,并用限制性内切酶进行酶切和测序验证。(2)将重组表达载体p ET28a(+)-Der f5转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株中。用IPTG小剂量诱导表达der f5蛋白,优化条件进行大规模表达和纯化;(3)构建变应原der f5致敏的小鼠哮喘模型,用纯化的变应原der f5为疫苗对小鼠哮喘模型进行特异性免疫治疗。最后1次雾化吸入24 h后,收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)、分离血清,同时进行脾细胞培养。对BALF中白细胞总数和嗜酸性粒细胞(EOS)数目计数;ELISA法分别检测BALF中和脾细胞培养...

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
前言
第一部分 粉尘螨第Ⅴ类变应原Der f5基因的克隆、原核表达重组载体的构建与表达
    研究内容
    材料与方法
        1 材料
            1.1 质粒
            1.2 菌株
            1.3 引物
            1.4 粉尘螨
            1.5 主要试剂
            1.6 主要仪器和设备
            1.7 主要试剂配制
        2 方法
            2.1 粉尘螨总RNA的提取
            2.2 Der f5基因的克隆与鉴定
            2.3 p ET28a(+)-Der f 5 重组表达载体的构建
            2.4 Der f5蛋白的小剂量诱导表达
            2.5 Der f5蛋白的大剂量诱导表达
            2.6 Der f5蛋白的纯化及鉴定
            2.7 纯化产物的Western blot分析
            2.8 Der f 5 蛋白浓度的测定
    结果
        1 目的基因Der f5的c DNA片段RT-PCR扩增
        2 重组克隆载体p UC57-Der f5的构建及酶切鉴定
        3 重组表达质粒p ET28a(+)-Der f 5 的鉴定
        4 Der f5蛋白的SDS-PAGE分析
        5 Der f5重组蛋白的纯化
        6 纯化产物的免疫印记（Western blot）鉴定
        7 Der f5蛋白浓度测定
    讨论
第二部分Der f5重组蛋白对哮喘小鼠免疫治疗的效果分析
    研究内容
    材料与方法
        1 材料
            1.1 实验动物
            1.2 主要试剂
            1.3 主要试剂的配制
        2 方法
            2.1 实验分组
            2.2 哮喘小鼠模型的建立
            2.3 特异性免疫治疗
            2.4 血清抗原特异性Ig E和Ig G1和Ig G2a抗体含量测定
            2.5 支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞和白细胞总数计数
            2.6 BALF中特异性细胞因子IL-5、IL-17和IFN-γ 的检测
            2.7 ELISA法检测脾细胞培养上清中IL-5、IL-17和IFN-γ 因子含量
            2.8 肺组织病理切片观察
            2.9 数据分析
    结果
        1 各组小鼠症状和体征的改变
        2 检测小鼠血清中抗原特异性Ig E、Ig G1和Ig G2a抗体表达的含量
        3 支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞因子IL-5、IL-17和IFN-γ 的含量
        4 脾细胞培养上清液（SCSS）中细胞因子IL-5、IL-17和IFN-γ 的含量
        5 支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数和嗜酸性粒细胞数目计数
        6 肺组织切片HE染色
    讨论
结论
论文创新点
参考文献
综述
    参考文献
作者简介及读研期间主要科研成果
致谢



本文编号：3768606